借助 ibiTreat μ-Pattern 微图案由人诱导多能干细胞衍生的肝胆细胞制备自组织管状胆管类器官

前言

材料与试剂

• 源自艾伦细胞科学研究所（Allen Institute for Cell Science）的 hiPSC 细胞系 AICS-0023 (AICS23，mEGFP-TJP1)、AICS-0024 (AICS24，mEGFP-MYH10) 或 AICS-0058-067 (AICS58，mEGFP-CTNNB1)

请注意！上述所有细胞系都可以用于分化，不同的标记蛋白显示不同的细胞参数。

• ibidi μ-Pattern 微区块表面 8 孔高壁腔室载玻片（ibiTreat，cir500，pit1000，hex）（ibidi，83813）

• 12 孔培养板（Thermo Scientific，150628）
• 牛源胶原蛋白 I，按照制造商的规定制备（PureCol，5005）
• 0.01 N 盐酸
• 0.1 N NaOH
• 10× DPBS （Gibco，14080055）
• 1× DPBS （Gibco，14040133）
• 1× PBS
• 0.5% 胰蛋白酶-EDTA，无酚红（Gibco，15400054）
• mTeSR™ Plus（STEMCELL Technologies，100-0276）
• 生长因子减量（GFR）基质胶（Corning，354230）
• Y-27632（Sigma Aldrich，Y0503）

1）RPMI 基础培养基

• 10 mL 不含胰岛素的 B-27™ 添加剂（Gibco™，A1895601）
• 5 mL MEM 非必需氨基酸溶液（Gibco™，11140050）
• 5 mL 青霉素/链霉素双抗（Gibco™，15140122）

2）定型内胚层（DE）培养基

• 100 ng/mL 激活素 A（Activin A，R&D Systems，338-AC）
• 20 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，R&D Systems，233-FB）
• 10 ng/mL 骨形态发生蛋白4（BMP4，R&D Systems，货号314-BP）

3）前肠祖细胞（FP）培养基

• 50 ng/mL 激活素 A（R&D Systems，338-AC）

4）肝母细胞（HB）培养基

• 0.3 μL/mL 胰岛素（Gibco™，12585014）
• 10 μM SB 431542（STEMCELL Technologies，72232_C）
• 50 ng/mL 骨形态发生蛋白4（BMP4，R&D Systems，314-BP）

5）终止培养基

• 10% 胎牛血清（FBS，HyClone，SH30070.01）

6）改良 DMEM/F12 培养基

• 10 mL B-27™添加剂（Gibco™，17504044）
• 5 mL N2添加剂（Gibco™，17502048）
• 5 mL HEPES 缓冲液（Gibco™，15630106）
• 10 mM 烟酰胺（Sigma-Aldrich，N3376）
• 50 nM A83-01（STEMCELL Technologies，72022）
• 0.5 μM 二丁酰环磷腺苷（dbCAMP，STEMCELL Technologies，73882）
• 100 ng/mL 表皮生长因子（EGF，R&D Systems，236-EG）
• 20 ng/mL 肝细胞生长因子（HGF，R&D Systems，294-HG-005/CF）
• 500 ng/mL R-spondin 因子
• 50 ng/mL 成纤维细胞生长因子10（FGF10，R&D Systems，1277-JG-050）
• 5 mL 青霉素/链霉素双抗（Gibco™，15140122）

7）肝祖细胞（LP）培养基

• 2 μg/mL Jagged-1（Anaspec，AS-61298）
• 3 μM 视黄酸（Sigma-Aldrich，R2625）

8）肝胆（HepBili）培养基

• 30 μM 地塞米松（STEMCELL Technologies，72092）
• 20 ng/mL 骨形态发生蛋白4（BMP4，R&D Systems，314-BP）

实验步骤

1）接种细胞

• 根据艾伦细胞科学研究所（Allen Institute for Cell Science）于 2020 年发布的 1.7 版实验方案 ，传代并维持人诱导多能干细胞（hiPSCs）培养；
• 分化前准备：对细胞进行传代，按批次指定的稀释比例，在经 GFR 基质胶包被的 12 孔培养板中，以‌ 3×105cells/cm2">3×10⁵cells/cm² 密度接种于 mTeSR™ Plus 培养基中。

2）人诱导多能干细胞向肝母细胞（HB）分化（第 1~9 d）

• 第 1~2 d：确认接种后的人诱导多能干细胞已贴壁且汇合度达标，吸弃mTeSR™ Plus培养基，更换为定型内胚层（DE）培养基，每 24 h 更换培养基 1 次；
• 第 3~5 d：将定型内胚层（DE）培养基替换为前肠祖细胞（FP）培养基，连续 3 d 每 24 h 更换培养基 1 次；
• 第 6~9 d：将前肠祖细胞（FP）培养基替换为肝母细胞（HB）培养基，连续 4 d 每 24 h 更换培养基 1 次。

图1：人诱导多能干细胞向肝母细胞分化过程：分化过程中第 0 d的人诱导多能干细胞、第 5 d 结束时的前肠祖细胞、第 9 d 起始时的肝母细胞 3 个阶段的相差显微镜图像，比例尺示 20 μm。

3）在 ibidi μ-Pattern 微图案上接种肝母细胞

• 在 ibidi μ-Pattern 微区块表面 8 孔高壁腔室载玻片的每孔中加入 150 μL 1.5 mg/mL 牛源胶原蛋白 I ，包被 30 min；
• 用 1×PBS 缓冲液洗涤 ibidi μ-Pattern 微区块表面 8 孔高壁腔室载玻片各孔 5 次；
• 吸弃第 9 d 12 孔培养板中的肝母细胞培养基，用 1× PBS 缓冲液洗涤细胞 2 次；
• 在 12 孔培养板每孔的细胞中加入 300 μL 胰蛋白酶-EDTA，37℃ 孵育 3 min 令细胞解离；
• 将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，加入与胰蛋白酶等体积的终止培养基终止解离，随后 180 g 离心 5 min 以收集细胞；
• 用添加了10 μM Y-27632 的肝母细胞培养基重悬细胞沉淀，进行细胞计数；
• 以 1×105cells/cm2">1×10⁵ cells/cm2 密度将细胞接种至 ibidi μ-Pattern 微区块表面 8 孔高壁腔室载玻片各孔内，每孔液体体积不低于 300 μL；
• 将细胞置于37℃、5% CO2">CO₂ 、湿润培养环境中孵育过夜。

4）令肝母细胞向肝胆细胞分化（第 10~23 d）

• 第 10~13 d：吸弃 ibidi μ-Pattern 微区块表面 8 孔高壁腔室载玻片各孔内含 Y-27632 的肝母细胞培养基，更换为肝祖细胞培养基，连续 3 d 每 24 h 更换培养基 1 次；
• 第 14~23 d：将肝祖细胞培养基替换为肝胆培养基，后续 10 d 每 2~3 d 更换培养基 1 次。

图 2：在 ibiTreat μ-Pattern 微图案上，肝母细胞向肝胆细胞分化。

图 2 中，在直径为 500 μm 的 μ-Pattern 微图案上，第 9 d 结束时的肝母细胞、第 13 d 结束时的肝祖细胞、第 23 d 结束时的肝胆细胞 3 个阶段的相差与荧光镜检图像。AICS58 肝母细胞表达 mEGFP 标记的 CTNNB1，可标记细胞边界，便于细胞分割；AICS23 细胞表达 mEGFP 标记的 TJP1，可标记顶膜附近的紧密连接，用于判断细胞极性；AICS24 细胞表达 mEGFP 标记的 MYH10，可标记肌球蛋白 IIB，用于推算细胞的收缩能力。比例尺示 200 μm。

5）诱导管状类器官形成

• 参照下表配制所需体积的牛源胶原蛋白 I 凝胶：

• 以 150μL/cm2">150 μL/cm² 的用量为例，应在 ibidi μ-Pattern 微区块表面 8 孔高壁腔室载玻片每孔加入至少 300 μL 上述牛源胶原蛋白 I 凝胶，将细胞置于 37℃、5% CO2">CO2 、湿润培养环境中孵育过夜；
• 次日加入肝胆培养基继续培养。

图 3：胶原蛋白 I 包被 24 h 后 μ-Pattern 微图案上管状类器官的诱导效果。

图 3 展示了最大强度投影下细胞核（由 DAPI 染色）、肌动蛋白（由鬼笔环肽染色）以及 mEGFP 标记 TJP1 的相差与荧光合成图像。包被胶原蛋白 I 后，细胞开始向凝胶内迁移并形成管状结构，TJP1 定位于顶膜附近，可标记肝胆细胞形成的管腔。比例尺示 200 μm。