- 移动端
广州科适特科学仪器有限公司代理商
10 年
手机商铺
商家活跃：
产品热度：
- NaN
- 0.3999999999999999
- 1.4
- 0.3999999999999999
- 3.4
µ-Slides With Single-Cell µ-Pattern（单细胞µ-模式的µ-Slides载玻片）-货号83801
询价
推荐产品
公司新闻/正文
借助 ibidi ibiTreat μ-Pattern 微图案完成单细胞分析
30 人阅读发布时间：2026-07-15 09:17
前言
细胞群体内的个体在形态、基因表达水平或分化状态上存在差异，这会导致群体内部出现异质性偏差。为了在细胞实验中充分考量这类个体差异，应当对单细胞进行分析，而非对整个群体的结果取平均值。
ibidi 推出的 ibiTreat μ-Pattern 微图案可让单细胞长期黏附并培养在预设图案的限定位点上，这种将细胞「锚定」在固定位点的方式，支持对单个细胞进行长时间的追踪与分析。ibiTreat μ-Pattern 微图案可搭配不同蛋白包被使用，能针对实验所用的特定细胞系完成参数优化。
本实验方案提供了一个单细胞基因表达分析的完整示例，涵盖从蛋白包被、细胞接种、转染、成像到单细胞荧光信号分析的全部操作步骤。
材料与试剂
1）细胞与试剂
-
细胞：HuH7（JCRB Cell Bank - JCRB0403）
-
包被蛋白：层粘连蛋白（BioLamina，LN521-02）
-
转染相关试剂：
-
OptiMEM 培养基（Gibco，11085-021）
-
Lipofectamine 2000 转染试剂（ThermoFisher，11668027）
-
mRNA（实验室自制，编码增强型绿色荧光蛋白 eGFP）
-
其他试剂：
-
无酚红 Leibovitz L-15培养基（ThermoFisher，21083027）
-
无菌磷酸盐缓冲液（PBS）
-
无菌水
2）培养基
在添加有 GlutaMAX 的 RPMI 1640 培养基（ThermoFisher，61870036）中额外添加：
-
10% 胎牛血清（FBS，ThermoFisher，10437028）
-
5 mM HEPES缓冲液（ThermoFisher，15630080）
-
1 mM 丙酮酸钠（ThermoFisher，11360039）
3）实验设备
-
ibidi μ-Pattern 微区块表面 VI 0.4 六通道载玻片（ibiTreat，sqr30，pit75，hex）（ibidi，83611）
-
显微镜：尼康 TI Eclipse 倒置显微镜
实验步骤
请注意！实际使用的细胞数量及包被蛋白浓度需根据所用细胞系、μ-Pattern 微图案面积进行调整。
1）包被载玻片通道
-
包被载玻片通道时，推荐单位面积蛋白用量为 2∼5μg/cm2">2∼5μg/cm2 ；
-
用无菌 PBS 稀释层粘连蛋白母液至 20 μg/mL；
-
用无菌 PBS 润洗载玻片通道；
-
吸去通道内液体，加入 30 μL 上述层粘连蛋白溶液；
-
将载玻片 37℃ 孵育 1 h；
-
用 1 mL 无菌 PBS 多次洗涤通道（至少3次），随后即可接种细胞。
2）接种细胞
-
用细胞培养基置换载玻片通道内的PBS，分两次各加入 150 μL 培养基，确保载玻片通道内 PBS 被完全替换；
-
解离、收集细胞，随后用细胞培养基重悬，调整细胞浓度至 5×105cells/mL">5×105 cells/mL ；
-
在每个载玻片通道中加入 50 μL 上述细胞悬液（共 2.5×104">2.5×104 个细胞），由对侧 Luer 接口吸去多余培养基，将载玻片置于 37℃ 培养箱中孵育 1 h（不同细胞系、不同包被条件下该时长需调整）；
-
在显微镜下轻移载玻片以观察细胞贴壁情况，确认细胞位置固定、不再漂移后，用 150 μL 细胞培养基轻柔冲洗载玻片通道；
-
37℃ 孵育细胞 1~2 h，直至细胞完全贴附在 μ-Pattern 微图案上。
图 1：使用 10× 物镜对载玻片的一整条完整通道进行拼接成像。可见细胞分布均匀，绝大多数 μ-Pattern 微图案位点仅贴附单个细胞，该图像为接种细胞 30 h 后拍摄所得。
3）转染
后续步骤中，每载玻片通道 50 μL 体系内的最终 mRNA 用量需控制为 50 ng。
-
细胞完全贴壁后，用 150 μL OptiMEM 培养基轻柔冲洗每个载玻片通道；
-
37℃ 孵育细胞 1 h；
-
用 150 μL OptiMEM 培养基冲洗载玻片通道；
-
配制转染混合液：将 1 μg/mL mRNA 母液用无菌水稀释至 0.1 μg/μL，配制以下 2 种试剂：
-
试剂 A：2 μL Lipofectamine 2000 + 398 μL OptiMEM 培养基，室温孵育 5min；
-
试剂 B：98 μL OptiMEM + 2 μL 0.1 μg/μL mRNA；
-
取 100 μL 试剂 B 与 100 μL 试剂 A 混匀，室温孵育 20 min；
-
在每个载玻片通道内加入 50 μL 上述转染混合液；
-
令转染混合液与细胞在室温下共孵育 1 h；
-
用 L-15 培养基洗涤 2 次；
-
若成像时无需 CO2">CO2 孵育，成像前需在载玻片通道中加入 100 μL L-15 培养基；若需在 CO2">CO2 孵育条件下进行成像，使用不含酚红的常规细胞培养基即可。
4）镜检成像
-
将载玻片放置在显微镜载物台上，使用 10× 物镜进行成像；
-
在载玻片通道内选定多个不同的成像位点；
-
每 10 min 采集一次明场和目标荧光（GFP 通道）图像，最长连续采集 30 h。
图 2：10× 物镜下分别在 0、3、6、9、12、15 h 采集荧光信号的延时图像；可见随着培养时间推移，荧光信号强度逐步升高，同时有更多的细胞开始表达 eGFP。
单细胞荧光信号分析
实验者可对每个单细胞的荧光信号强度，以及对应的基因表达动力学参数进行定量测定。ibidi μ-Pattern 微图案对细胞的空间锚定作用大幅降低了细胞的自主移动，仅依托明场图像即可简化长时间的同细胞追踪操作，进而提取不同时间点的荧光强度数据。
1）PyAMA：Python 自动化微结构分析工具
荧光报告基因的表达分析可以用 PyAMA 软件自动完成。PyAMA（Automated Microstructure Analysis in Python，Python 自动化微结构分析工具）是一个基于 Python 开发的应用程序，用于显示、读取由延时荧光显微镜创建的 TIFF 图像序列中的单细胞荧光强度-时间动态曲线。该软件是开源的，可在 GitHub 上获得。
如需了解基于数学动力学速率模型解读荧光时间曲线的详细说明，可参考以下文献：
-
Reiser A, Woschee D, Kempe SM et al. (2021) Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) – a Versatile Technique to Quantify Cellular Kinetics. J. Vis. Exp. 169: e62025, doi: 10.3791/62025
-
Judith A. Müller, Nathalie Schäffler, Thomas Kellerer, Gerlinde Schwake, Thomas S. Ligon, Joachim O. Rädler "Kinetics of RNA-LNP delivery and protein expression" (2024) European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 197, 114222, doi: 10.1016/j.ejpb.2024.114222
图 3：使用 PyAMA 软件分析荧光报告基因表达。
全景图（左）中所有完成分析的细胞位点都被标记为绿色；曲线图（右）则展示了所有分析位点的荧光强度随时间的变化趋势，其中 3 条选中的特征曲线对应的细胞位点在全景图中被标记为红色。荧光强度随培养时长逐步上升，且 eGFP 表达水平、荧光强度的增长模式在每个细胞中都存在明显的个体差异。