T 细胞杀伤实验：ibidi μ-Pattern 微区块上的「八角笼中」

5）抗体

• 抗 PD-1 抗体（Biolegend，329926）
• 抗 PD-L1 抗体（Biolegend，329716）

6）其他

• 磷酸盐缓冲液（Gibco，14190-094）
• 0.01 M HCl（Merck，1.09057）

7）显微镜

• 明场显微镜（4× 物镜）
• 电动载物台
• ibidi 载物台培养箱，温度设为 37°C，二氧化碳浓度设为 5%

实验步骤

1）包被

• 用 0.01M HCl 将胶原蛋白 I 稀释至 10 µg/mL；
• 在每载玻片腔室中各加入 150 µL 上述胶原蛋白 I 包被溶液；
• 将载玻片在 37°C 下孵育 1 h；
• 用 300 μL 无菌磷酸盐缓冲液洗涤各腔室 5 次。

2）接种肿瘤细胞

• 将肿瘤细胞用培养基稀释至最佳接种浓度（经预实验确定）—— RCC 细胞体积较大，最佳接种浓度为 2.5×104cells/mL">2.5×10⁴cells/mL ；
• 在各个载玻片腔室中加入 300 μL 上述肿瘤细胞悬液；
• 在 37°C 培养箱中孵育肿瘤细胞 5 h，令其贴壁；
• 用 300 μL 无细胞培养基洗涤各载玻片腔室 3 次，以除去未贴壁细胞；
• 镜检肿瘤细胞在 μ-Pattern 微区块上的汇合度——对于 RCC-26 及 RCC-53 细胞，在接种浓度为 2.5×104cells/mL">2.5×10⁴cells/mL 、贴壁时间为 5 h，并在初始贴壁及洗涤步骤后，再 37°C 下培养 12~16 h，即可达到形成肿瘤细胞单层的最佳汇合度。

3）加入 T 细胞

• 制备 T 细胞悬液——本实验采用以下 T 细胞悬液及对照试剂：

α） 2.5×104cells/mL">2.5×10⁴cells/mL T 细胞悬液；
β） 2.5×104cells/mL">2.5×10⁴cells/mL T 细胞悬液，加有 20 μg/mL 抗 PD-1 抗体及抗 PD-L1 抗体；
γ）不含 T 细胞的培养基（作为空白对照）。

• 将接种有肿瘤细胞的每个腔室中的培养基替换为 300 μL 上述 T 细胞悬液或对照试剂。

请注意！应迅速操作，以免细胞因干燥而失活。

4）镜检成像

• 将载玻片放置在装有载物台培养箱（37°C，5% CO2">CO2）的显微镜（4× 物镜）上。
• 在每个载玻片腔室中选择至少 2×9 个镜检视野，每个镜检视野中因 µ-Pattern 微区块的尺寸及物镜放大倍率不同，所包含 μ-Pattern 微区块的数量亦有所不同（例如，在采用直径为 200 μm 的 μ-Pattern 微区块及 4× 物镜时，一个视野中将包含 4~5 个 μ-Pattern 微区块）；镜检视野应选在细胞汇合度接近 100% 且为细胞单层（即细胞未见堆叠式生长）的位置；
• 在前 3 h 内以较短的时间间隔（10 min）在明场下镜检成像；随后以较长的时间间隔（2 h）镜检成像直至实验结束（本实验中总镜检时长为 3 d）。

5）结果与分析

T 细胞的杀伤效力通过在 T 细胞与肿瘤细胞共培养的 75 h 内测定每个时间点 μ-Pattern 微区块内肿瘤细胞的汇合度来评估。评估应在加入 T 细胞时肿瘤细胞已接近形成单层汇合的 μ-Pattern 微区块上进行。针对每种共培养条件，均对 9 个 μ-Pattern 微区块进行分析，并随时间推移进行追踪记录。示例图像如图 1 所示。

 

图 1

 

随后，如图 2 所示，于各时间点计算所选取的 9 个 μ-Pattern 微区块上肿瘤细胞汇合度平均值，并将其结果展示于 Y 轴，与 X 轴所对应的时间（单位：h）形成关联。

 

图 2

 

• 在早期时间点（00:40 h），所有 μ-Pattern 微区块上肿瘤细胞均显示完全汇合；
• 不含 T 细胞的空白对照（图 1 的第 1 行及第 3 行、图 2 中的橙色线）显示，随时间推移，肿瘤细胞汇合度没有降低，表明没有发生非 T 细胞依赖性的细胞死亡；
• 在 RCC-26 细胞与 TCR53/CD8 T 细胞的共培养体系中（图 1 的第 2 行，图 2 中的粉色线），肿瘤细胞汇合度迅速下降，07:40 h 时 μ-Pattern 微区块上肿瘤细胞覆盖率低于 50%，至 35:40 h 时 μ-Pattern 微区块上已无细胞；
• 在 RCC-53 细胞与 TCR53/CD8 T 细胞的共培养体系中（图 1 的第 4 行，图 2 中的绿色线），07:40 h 时 μ-Pattern 微区块上肿瘤细胞覆盖率仍为 100%，至 49:40 h 时降低幅度小于 50%；
• 当在 RCC-53 细胞与 TCR53/CD8 T 细胞的共培养体系中（图 1 的第 4 行，图 2 中的绿色线）中加入抗 PD-1 抗体及抗 PD-L1 抗体时，与未添加抗体的 TCR53/CD8-RCC-53 共培养体系相比，该共培养体系中肿瘤细胞汇合度下降得更快——这表明 PD-1/PD-L1 阻断作用增强了 T 细胞对 RCC-53细胞的杀伤效力，然而，该效力并未达到对 RCC-26 细胞的杀伤水平（图 1 的第 5 行，图 2 中的绿色虚线）。

结果表明，TCR53/CD8 T 细胞对 RCC-26 肿瘤细胞的杀伤速度更快，效率也更高。添加抗 PD-1 抗体及抗 PD-L1 抗体提高了 TCR53/CD8 T 细胞对 RCC-53 肿瘤细胞的杀伤效力。

 

结论

研究发现，同一 T 细胞群体针对不同的肿瘤细胞系具有不同的杀伤效果。在此示例中，相同的 TCR53 转基因 T 细胞对 RCC-26 肿瘤细胞的杀伤效率远高于对 RCC-53 肿瘤细胞系的杀伤效率。本研究还进一步证实，通过添加检查点阻断抗体（如抗 PD-1/抗 PD-L1 抗体），可以增强 T 细胞的杀伤效力。

 

研究结果还表明，具有 μ-Pattern 微区块的 ibidi 多腔室载玻片作为一种高通量细胞实验平台，具有良好的操作性——多腔室设计允许在同一实验中研究不同的条件，即不同的肿瘤细胞系、不同的培养基添加剂或不同的 T 细胞；同时，由于 μ-Pattern 微区块阵列的存在，每种条件都包含多个微区块重复样本，以便进行个体数据收集，从而支持统计分析。

背景知识：RCC 细胞系及 TCR53/CD8-T 细胞

RCC-26 和 RCC-53 是 2 种源自透明细胞肾细胞癌（ccRCC）的细胞系，它们分别从 2 名处于不同肿瘤分期及转移状态的患者原发肿瘤中建立而来。RCC-26 细胞系源自一名分化良好、体积较小且处于早期阶段的肿瘤，该肿瘤在诊断时尚未发生转移。相比之下，RCC-53 细胞系则源自一名分化不良、体积较大且处于晚期阶段的肿瘤，该肿瘤已转移至多个器官。TCR53/CD8-T 细胞是经过基因转导的人类原代 T 细胞，能够表达 T 细胞受体 TCR53 以及共受体 CD8。TCR53 对 RCC-26 及 RCC-53 细胞具有 HLA-A2 限制性的特异性，能够刺激细胞因子释放并引发细胞毒性作用。

 

当 T 细胞进入肿瘤微环境时，常常会观察到其功能丧失 。多项研究将这一现象归因于肿瘤微环境所起的抑制作用，该作用促进了肿瘤的免疫逃逸并阻止了肿瘤细胞的清除 。其中一种机制是 T 细胞上免疫抑制性受体（如 PD-1）的上调，当 PD-1 与肿瘤细胞上的配体 PD-L1 结合时，会触发 T 细胞内的抑制性信号通路 。为探究 PD-1/PD-L1 抑制在 T 细胞介导的细胞杀伤中的作用，实验者可在 T 细胞与肿瘤细胞的共培养体系中添加抗 PD-1/PD-L1 抗体，以阻断 2 中细胞之间的相互作用。