手把手教你高效完成细胞免疫荧光染色

建议提前一天将 ibidi µ-Slide 通道载玻片和细胞培养基置于培养箱内以平衡气压。

收集细胞悬液，调节细胞密度至 1×103 cells/ml，载玻片的每个通道中迅速加入 30 µL 细胞悬液。

轻轻倾斜载玻片并敲击其侧边，以去除通道中可能残留的气泡。使用附带的盖子封闭两侧储液池。将载玻片连同载玻片滑架放入培养箱孵育 1 h，使细胞贴壁。

向每个储液池中小心注入 60 µL 无细胞培养基，防止引入气泡。

使用移液器吸取储液池中的培养基，确保不触及并吸出通道内部的任何液体。轻轻地将 120 µL 无细胞培养基注入储液池中，以补充通道中的培养基。

在从对侧的储液池吸取旧培养基时，务必保持谨慎，以防移液操作冲走已贴壁的细胞或细胞团。每个储液池应使用 60 µL 无细胞培养基进行重新填充。

采用无断流更换法（如上图所示），使用杜氏磷酸盐缓冲液替换细胞培养基以洗涤细胞。吸去大部分的杜氏磷酸盐缓冲液，但需保留一小部分以避免细胞损伤。

用 100 µL 10% 福尔马林固定细胞 20 min。

用 200 µL 杜氏磷酸盐缓冲液通过无断流更换法先后洗涤细胞 3 次。

吸去大部分的杜氏磷酸盐缓冲液，但需保留一小部分以避免细胞损伤。加入 100 µL 透化缓冲液，孵育细胞 5 min。

用 200 µL 杜氏磷酸盐缓冲液通过无断流更换法洗涤细胞。吸去大部分的杜氏磷酸盐缓冲液，但需保留部分体积以避免细胞损伤。

用 100 µL封闭缓冲液封闭细胞 20 min。

封闭完成后，再次使用 200 µL 杜氏磷酸盐缓冲液，通过无断流更换法洗涤细胞。

彻底排空储液池和通道内的杜氏磷酸盐缓冲液。

用 5 mL 注射器（此举可最.大程度地避免引入气泡）迅速将 30 µL iFluor 488 标记鬼笔环肽溶液加入到通道中。

避光孵育 20 min——自此时起，应确保样品处于持续的黑暗环境中。

使用 200 µL 杜氏磷酸盐缓冲液，通过无断流更换法先后洗涤细胞 2 次。

彻底排空储液池和通道内的杜氏磷酸盐缓冲液，随后立即注入含有 DAPI 的 ibidi 封片剂以进行细胞核染色，直至通道被完全填充。

将封片完毕后的载玻片 4°C 避光保存（至多可保存 4 周），直至进行镜检成像。

在荧光显微镜下使用适当的滤片组和 ibidi 镜油镜检。