师姐秘传 3D 细胞培养 protocol ，导师看了直呼高手！（送超实用载玻片）

1. 试剂与缓冲液

● HUVEC 细胞，（C-12203，PromoCell）

● 内皮细胞生长培养基（PromoCell，C-22010）

● 大鼠尾源胶原蛋白 I，未经胃蛋白酶处理，5 mg/mL （50201，ibidi）

● 牛源胶原蛋白 I，未经胃蛋白酶处理，5 mg/mL（50301，ibidi）

● Cultrex 三维培养基质层粘连蛋白 I，6 mg/mL（3446-005-01，R&DSystems）

● 10× 磷酸盐缓冲液（70011-044，Gibco）

● 1.25 M 及 7 M NaOH 溶液，以超纯水配制

● 0.1 M 及 17.5 mM 乙酸溶液

2. 仪器与耗材

● ibidi μ-Slide 3D 载玻片，ibiTreat（81506，ibidi）

● μ-Slide 载玻片滑架

● 用于确定最佳基质胶体积的刻度纸

● 冰块或适当的冷却架

● 标准细胞培养设备（移液器、无菌工作台、细胞培养培养箱、培养瓶、血细胞计数板等）

● 倒置显微镜

● 可选项：带有吸头的多通道移液器

实验者须在无菌条件下进行以下所有步骤！

层粘连蛋白-胶原蛋白 I 基质胶可以用大鼠尾源胶原蛋白 I 或牛源胶原蛋白 I 制备——对于这两种情况，实验者必须首先制备 4 mg/mL 的胶原蛋白 I 凝胶（详见「制备胶原蛋白 I 凝胶」一节中的相关指引）。

移液凝胶时的注意事项：

① 务必使用预冷到 4 ℃ 的移液器吸头对凝胶进行移液！

② 在制备层粘连蛋白-胶原蛋白 I 凝胶时，鉴于其高粘度特性，建议对包含层粘连蛋白与胶原蛋白 I 的所有操作步骤实施反向移液。

其具体操作为：先将移液器按压至预设的第二压力点，使凝胶完全填充移液器吸头；待分配凝胶时，仅达到第一压力点即行释放，此举可确保移液器吸头内残留的凝胶被排除，同时确保分配体积的精确度。另外，为优化操作，可选用专为高粘度液体设计的移液器，如 Eppendorf Visco 系列吸头或 Gilson Microman E 型移液器，以提高工作效率。

③ 请特别注意，即便在 4°C 条件下，凝胶混合物在发生初步凝胶化前的可操作时间也仅限于大约 5 min，因此需严格控制操作时间以保证实验效果。

● 在实验前一日，将层粘连蛋白 I 放在 4 °C 冰箱中的冰上，使其缓慢解冻过夜；

● 实验当日，需预先将凝胶制备所需的全部材料，以及一个无菌试管（其容量应足以容纳最终凝胶的总体积）放置于层流罩内的冷却架上。在凝胶的整个制备过程中，务必保持所有材料及凝胶处于冷却架上。

1、制备胶原蛋白 I 凝胶

关于胶原蛋白 I 浓度的注意事项：

① 由于生产过程中的批次间差异，试剂瓶内胶原蛋白 I 的浓度可能会存在波动。

② 在制备 4 mg/mL 的最终工作溶液之前，需先将胶原蛋白 I 制为 4.5 mg/mL 浓度的母液。

③ 在制备过程中，建议查阅胶原蛋白 I 产品页面上的分析证书（CoA），该证书详细记录了每个批次特定的胶原蛋白浓度信息。

● 进行稀释前，将试剂瓶中的胶原蛋白 I 反复吹打混匀；

● 制备胶原蛋白 I 母液：将胶原蛋白 I 稀释至 4.5 mg/mL，大鼠尾源胶原蛋白 I 用 17.5 mM 乙酸进行稀释，牛源胶原蛋白 I 用 0.1 M 乙酸进行稀释；在进行稀释操作前，务必参考该批次产品的分析证书（CoA），以获取准确的胶原蛋白 I 浓度信息；制备 4 mg/mL 胶原蛋白 I 工作溶液：将试管放在冷却架中，按照表 1 所示顺序，逐一将除胶原蛋白 I 之外的所有组分加入已预冷的试管内，反复吹打以充分混匀管内容物；随后，向上述试管中缓缓加入适量胶原蛋白 I 母液至 4 mg/mL 工作浓度，反复吹打以充分混匀管内容物；试管须始终置于冷却架内。

表 1：用于配制 4 mg/mL 胶原蛋白 I 工作溶液的移液方案

2、制备层粘连蛋白-胶原蛋白  I  凝胶

● 将层粘连蛋白工作溶液与胶原蛋白 I 工作溶液以 1：4 体积比混合（例如，将 400 μL 层粘连蛋白工作溶液与 100 μL 胶原蛋白 I 工作溶液混合）；试管始终置于冷却架内，用移液器反复吹打混匀；现在，凝胶混合溶液业已制备完毕，可将其加入 μ-Slide 3D  载玻片中。

3、在载玻片中加入基质胶

● 在层流罩下，从无菌包装中取出 ibidi μ-Slide 3D 载玻片；

● 将一张刻度纸放入载玻片下方，以调节基质胶体积——确保刻度纸和孔之间的距离为约 1~2 cm；

● 务必使用预冷到 4 ℃ 的移液器吸头对凝胶进行移液；

● 为防止凝胶内部形成气泡，需在将凝胶溶液注入孔中之前，用 10 μL 移液器在凝胶溶液中轻柔吹打 3 次进行充分混合，同时保持吸头始终浸没在凝胶溶液中；向 μ-Slide 3D 载玻片的每个孔中加入10 μL 基质胶；加入基质胶时，应将移液器枪头直立在孔中央，以免基质胶流入外孔；用盖子盖上载玻片。

图 2：在 μ-Slide 3D 载玻片中加入基质胶。

如何调整基质胶体积？

表面平坦的无凹液面基质胶对于获得最佳的成像质量至关重要。为此，每个内孔中的基质胶体积需要精确到 10 μL。然后，由于层粘连蛋白-胶原蛋白 I 凝胶溶液粘度高的特性，实验者可能需要将移液枪的移液体积调整到大于或小于10 μL。为了控制基质胶用量，可将 ibidi μ-Slide 3D 载玻片放在刻度纸上方 1~2 cm 处，然后通过孔观察刻度纸的网格。若基质胶体积精确到 10 μL，网格不会放大或缩小；若刻度纸的网格缩小，则需要增加移液体积；反之，若网格放大，则必须减少移液体积。

图 3：使用刻度纸调整μ-Slide 3D 载玻片中的凝胶体积。

4、凝胶化

● 如下图所示，将载有基质胶的 μ-Slide 3D 载玻片与无菌湿纸巾一同放入一个10 cm 的培养皿中，并盖上皿盖，用以保持实验环境的湿度；

● 将上述培养皿置于 37°C 培养箱中孵育 60 min，以促进凝胶聚合；

● 同时制备细胞悬液（请参阅「接种细胞」一节）。

图 4：将μ-Slide 3D 载玻片放入加湿室中。

基质胶表面上接种的细胞数量是在血管生成实验中获得可靠结果的关键参数。细胞的类型和大小决定细胞接种数量，因此，在开始正式实验之前，必须进行预实验以优化细胞接种方案。为保证实验效果，实验者须使用较低代次的 HUVEC 细胞（至多 P6 代）。

图 5：用多通道移液器在 μ-Slide 3D 载玻片中接种细胞。

请在使用 ibidi μ-Slide 3D 载玻片之前仔细阅读产品说明书，并在无菌条件下进行所有步骤。开始实验前，在标准细胞培养瓶中制备人脐静脉内皮细胞悬液（例如，在 T75 细胞培养瓶中，用 6.7 g/mL 胶原蛋白 IV 在 0.05 M HCl 中包被 1 h)，使得细胞在培养瓶底贴壁。细胞健康状态应良好且在实验当天处于最佳的亚融合状态。整个过程中，操作必须迅速，以免孔中基质胶干涸。

如果未另外说明，则所有给定体积均为每孔体积，且所有培养步骤均在室温下进行：

● 用 Accutase 细胞解离液解离人脐静脉内皮细胞 1~2 min；

● 收集细胞悬液，离心，在少量培养基中重悬，用于计数（此处培养基的用量取决于所需的细胞浓度）；

● 计数细胞。应尽可能准确地进行计数，并且始终以相同的方式进行，以使得所有孔中的细胞数量相同。为使得每孔中最终细胞数为 5,000 个，用新鲜无细胞培养基将细胞悬液调整至 1×105 cells/mL 的最终浓度；

● 从培养箱中取出载有基质胶的 ibidi μ-Slide 3D 载玻片，并将其放在无菌层流罩下；

● 在将细胞悬液加入孔中之前，先用移液枪轻柔吹打混匀数次，在每个外孔中加入 50 µL 细胞悬液。保持移液枪枪头直立，不要用移液枪枪头接触基质胶；

● 用随附的盖子盖住载玻片——亦可选用 ibiSeal 71 x 107 自粘覆膜（10875, ibidi），自粘覆膜可用于可用于覆盖孔，展平基质胶凹液面，从而增强相差显微镜的成像效果；

● 对 ibidi μ-Slide 3D 载玻片进行镜检——静置数分钟后，细胞沉降至基质胶表面，血管形成随即开始；没有了凝胶凹液面的干扰，这些血管可在同一个焦平面上成像。

图 6：静置数分钟后，细胞沉降至基质胶表面，血管形成随即开始。

血管生成过程可通过采用明视野显微镜、相差显微镜或荧光显微镜进行成像分析。

显微镜上的数据收集操作既可手动或自动进行。尤其是在初次进行血管生成实验时，我们推荐采用自动化手段，通过录制延时视频来捕获数据，以便于分析时间依赖性和曲线特征（诸如最大形成阶段与稳定阶段）。在后续的实验中，针对物质对血管生成影响的探究，单次手动测量通常已足够提供所需信息。

对于使用 HUVECs 的实验，我们推荐的显微镜放大倍率为 4× 或 10×，并设定单帧之间的时间间隔为 5 min，持续观察时间至少需达到 5 h。为了量化血管生成的程度，可基于一系列参数对采集的图像进行深入分析，包括但不限于管长、闭合环路的数量、细胞所覆盖的区域面积以及分支点的数量等。

层粘连蛋白-大鼠尾源胶原蛋白 I 基质胶与层粘连蛋白-牛源胶原蛋白 I 基质胶均能诱导血管网络的形成。培养 2 h 后，可明显观察到血管结构、环路及分支点的形成。

与 Matrigel^® 基质胶相比，这两种基质在所形成的血管网络结构上以及网络形成的动力学特征上存在显著差异。尽管本应用指南未深入探讨这些基质间差异的具体原因及其详细分析，但三者均适用于评估特定物质在促/抗血管生成过程中对血管网络生成关键检测指标的影响。

图 7：在 μ-Slide 3D 载玻片中用 HUVECs 进行血管生成实验的时间推移图像。在将细胞接种于 Matrigel 基质胶 (左)、层粘连蛋白-大鼠尾源胶原蛋白 I 基质胶 (中) 以及层粘连蛋白-牛源胶原蛋白 I 基质胶(右)上培养 0 h、2 h、4 h、6 h 和 24 h，用 4× 物镜进行相差显微镜镜检。