在 ibidi 96 孔黑色培养板中对由 iPS 细胞衍生的多巴胺能神经元进行免疫荧光染色

前言

 

本应用指南描述了使用 ibidi µ-Plate 96 孔黑色培养板（ibidi，89626）对 iPS 细胞衍生的多巴胺能神经元进行免疫荧光染色的过程。请参考其他实验方案以了解如何由 iPS 细胞诱导生成多巴胺能神经元。

 图 1：ibidi µ-Plate 96 孔黑色培养板（ibidi，89626）

 

材料与试剂

1）细胞与试剂

• 分化第 30 d 的 iPS 细胞衍生的多巴胺能神经元（原始 iPS 细胞系：1231A3）
• iMatrix-511（Nippi）
• Neurobasal 培养基（Thermo Fisher Scientific，21103049）
• B27（Thermo Fisher Scientific，12587010）
• Glutamax-I（Thermo Fisher Scientific，A1286001）
• 胶质细胞源性神经营养因子（GDNF，Wako）
• 抗坏血酸（Wako）
• 脑源性神经营养因子（BDNF，Wako）
• 二丁酰环磷腺苷酸（dbcAMP，Sigma-Aldrich）
• Y-27632（Fujifilm）
• 多聚甲醛
• 磷酸盐缓冲液
• 普通驴血清
• Triton X-100 透化剂
• Tween 20

2）缓冲液与溶液

• Neurobasal培养基
• B27（每 500 mL Neurobasal 培养基加入 10 mL B27）
• 2 mM Glutamax-I
• 10 ng/mL 胶质细胞源性神经营养因子
• 200 µM 抗坏血酸
• 20 ng/mL 脑源性神经营养因子
• 400 µM dbcAMP（二丁酰环磷腺苷酸）
• 20 µM Y-27632（在接种细胞时加入培养基中，以抑制由机械压力引起的细胞凋亡）

• 磷酸盐缓冲液
• 2~2.5% 普通驴血清
• 0.3%（体积分数）Triton X-100 透化剂

• 磷酸盐缓冲液
• 0.05%（体积分数）Tween-20

3）仪器与设备

• ibidi µ-Plate 96 孔黑色培养板，经 ibiTreat 处理（ibidi，89626）
• 层流罩
• 培养箱（37°C，5% ）
• 移液器及适配吸头
• 倒置显微镜（本实验使用 Keyence BZ-X710 显微镜）

实验步骤

1）样品制备

• 在无菌条件下执行所有步骤；
• 在每孔中加入以 90 µL 磷酸盐缓冲液稀释的 0.55µL（0.28 µg）iMatrix-511，在 37°C 下孵育 1~24 h，以覆盖培养板；
• 将 iPS 衍生的多巴胺能前体细胞以每孔 180µL 神经分化培养基的密度（即每孔含 个细胞）接种到 ibidi µ-Plate 96 孔黑色培养板上；
• 在 37°C 下孵育 iPS 细胞 7 d（即共分化 37 d）；
• 每 2~3 d 轻轻更换一半的培养基——由于神经细胞容易从培养表面脱落，因此不建议更换全部培养基。

2）固定

• 吸去细胞培养基。；
• 在每孔中加入适量 4% 多聚甲醛，并在 4°C 下孵育细胞 30 min；
• 吸去多聚甲醛；
• 在各孔中加入适量磷酸盐缓冲液。

3）透化及封闭

• 吸去磷酸盐缓冲液；
• 以封闭缓冲液室温孵育细胞 1 h。

4）一抗染色

• 将一抗以封闭缓冲液稀释，制得一抗染色溶液；
• 弃去封闭缓冲液，并立即进行下一步——切勿使得细胞干燥；
• 加入一抗染色溶液，室温孵育细胞过夜；
• 用洗涤缓冲液洗涤细胞 3 次。

5）二抗染色

• 将二抗以封闭缓冲液稀释，制得二抗染色溶液；
• 弃去封闭缓冲液；
• 加入二抗染色溶液，室温孵育细胞过夜；
• 用洗涤缓冲液洗涤细胞 2 次。

6）复染

• 将 DAPI 用磷酸盐缓冲液以 1:48,000 体积比稀释，制得复染溶液；
• 弃去洗涤缓冲液；
• 将复染溶液添加到细胞中，并在室温下孵育 10 min；
• 用洗涤缓冲液洗涤细胞 1 次；
• 以磷酸盐缓冲液填充各孔，并将样品避光保存直至镜检。

7）镜检成像

根据制造商给出的方案，使用荧光显微镜对细胞进行镜检成像。

 

图 1：在ibidi  µ-Plate  96孔黑色培养板中拍摄的人诱导多能干细胞（iPSCs）来源的多巴胺能神经元的免疫荧光图像。