通道载玻片中贴壁细胞的培养和解离

前言

ibidi µ-Slide VI0.4 通道载玻片是一款功能多样的实验工具，既适用于细胞培养又便于显微镜镜检。它能够在六个通道中支持细胞的均匀分布，因此特别适用于免疫荧光和活细胞成像检测。这款载玻片是观察细胞结构，如肌动蛋白细胞骨架和线粒体等细微之处的理想选择。此外，其低容积设计使得实验能够以更少的细胞和试剂量进行，从而提高了实验的成本效益。值得一提的是，这款通道载玻片还能够适应静态培养和灌流培养两种不同的条件，展现了其广泛的适用性。

图1：ibidi µ-Slide VI0.4 通道载玻片

本实验方案详细阐述了 ibidi µ-Slide VI0.4 通道载玻片在接种细胞、更换培养基和解离贴壁 HT-1080 细胞过程中的最佳处理技术，这些技术均是根据载玻片的独特功能精心设计的。在解离细胞时，本方案推荐使用 Accutase 细胞解离液。当然，根据实验的具体需求，实验者也可以选择使用胰蛋白酶作为替代方案。

实验材料

试剂与缓冲液

• HT-1080 细胞（85111505，Sigma Aldrich）
• 细胞培养基： DMEM（D6546，Sigma Aldrich），含 10% 胎牛血清（F1283，Sigma Aldrich）
• 杜氏磷酸盐缓冲液 (14190144, Gibco)
• Accutase 细胞解离液（A1110501，Gibco）

实验仪器与耗材

• µ-Slide VI 0.4 通道载玻片，经 ibiTreat 亲水处理 (80606, ibidi)
• µ-Slide 载玻片滑架 (80003, ibidi)
• 标准细胞培养设备（移液枪、无菌工作台、细胞培养箱、培养瓶、血细胞计数器等）
• 相差显微镜

实验方法

接种细胞

在使用 µ-Slide VI0.4 通道载玻片之前，请您务必仔细阅读其使用说明书。整个操作过程都应在无菌条件下进行。为了防止在操作过程中产生气泡，我们建议在接种细胞的前一天就将 µ-Slide VI 0.4 通道载玻片和细胞培养基放入培养箱中。实验开始前，您需要在标准的细胞培养瓶（例如 T75 细胞培养瓶）中制备HT-1080细胞，并确保培养瓶底部有贴壁细胞。同时，细胞最好在实验当天处于亚融合状态，并且状态健康。

在整个过程中必须迅速操作，以防止细胞干燥。如无特别说明，所有给定体积均为每个通道的容积。

图 2：接种细胞

1. 在 T75 细胞培养瓶中加入 10 mL Accutase 细胞解离液以解离细胞；在培养箱（37°C，5%CO₂）中培养 5 min。加入等体积（10 mL）的细胞培养基，终止 Accutase 反应。收集细胞悬液，1000 rpm 离心 3 min，用少量细胞培养基重悬后进行计数。计数细胞，用无细胞培养基调整细胞悬液至最终浓度为  。拆开 ibidi µ-Slide VI 0.4 通道载玻片的包装，将其放在 µ-Slide 滑架或适当的表面上。将 30 µL  HT-1080 细胞悬液直接移入每个通道。快速加液并在加液时将移液枪枪头伸入通道（如下图所示）——此举有助于避免残留气泡。倾斜 µ-Slide 通道载玻片并轻敲一侧边缘，以清除通道中的残留气泡。用提供的盖子盖住储液池。将 µ-Slide 通道载玻片连同载玻片滑架放入培养箱（37°C，5%CO₂ ）孵育 1 h，使细胞贴壁。在每个储液池中各加入 60 µL 细胞培养基，不要夹带气泡。将 µ-Slide 通道载玻片连同 μ-Slide 滑架放入培养箱（37°C，5%CO₂，培养细胞过夜。
2. 若要延长细胞培养时间，建议每隔一天连续更换一次培养基（详见“更换培养基”一节）。

更换培养基：无断流更换法

图 3：更换培养基

1. 小心地吸出储液池中的培养基，务必避免从通道本身吸出任何液体。在操作时，将移液枪枪头指向远离通道口的方向，这样有助于防止误吸通道内的液体。
2. 轻轻地将 120 µL 新鲜细胞培养基注入一侧的储液池，让培养基随重力补充到通道中。
3. 小心吸出另一侧储液池中的旧细胞培养基。在使用细胞培养吸液装置时，请特别注意，以免冲走部分附着的细胞或细胞团。此时，同样建议将枪头指向远离通道口的方向。
4. 在两侧储液池中各加入 60 µL 细胞培养基，以重新填充储液池。

细胞解离

图 4：细胞解离

1. 更换培养基后，小心地用连续更换法在通道中加入杜氏磷酸盐缓冲液以求将细胞培养基全部冲出，从而达到洗涤细胞的目的。
2. 小心吸出通道中全部的洗涤液。
3. 将移液枪枪头直接放在通道口处，立即向通道中注入 30 µl 的 Accutase 细胞解离液。
4. 在 37°C 条件下孵育细胞 5 min。
5. 使用相差显微镜确认细胞是否成功解离。细胞是否解离可通过细胞形态是否变圆来判断（若细胞变圆，则已成功解离）；如果细胞仍贴壁，则继续孵育几分钟。
6. 用 100 µL 细胞培养基冲洗每个通道，以终止细胞解离。
7. 从对侧的储液池吸出细胞悬液；若有细胞残留在通道中，则重复冲洗步骤。
8. 细胞悬液 1000 rpm 离心 3 min，弃上清，然后进行后续操作。