免疫荧光实验

ibidi提供了一种简单且经济高效的方案，使用ibidi3孔可移除腔室载玻片（80381）对细胞进行培养、固定和染色。培养MCF-7细胞并用formalin溶液固定。细胞核用DAPI染色，肌动蛋白骨架用DYE-490鬼笔肽染色。可通过使用圆形的15mm盖玻片来减少所需的染色溶液的量。利用一级和二级抗体染色，通过免疫细胞化学可以探测其他细胞内结构。

实验使用的材料：

所使用的材料和试剂如下所示。此外，还需要配备一台有适当滤光片组的倒置或正置荧光显微镜。

• 3孔可移除腔室载玻片（ibidi，80381）
• 3孔可移除培养专用圆形15mm盖玻片及配套工具，（ibidi，10815）
• 细胞：MCF-7（CLS，300273）
• 细胞培养基
• 细胞培养试剂
• PBS
• formalin中性缓冲液，10%（Sigma，HT5001）
• 染色试剂     DAPI（Sigma，D954）DYE-490鬼笔环肽（Dynomics，490-33）
• 封片剂：FluoroshieldTM（Sigma，F6182）

实验方案

细胞培养，固定，染色和成像观察--都是在一个小室中完成。

第一步：

必须在预实验中确定细胞系的正确接种浓度。根据您的细胞类型，用2-6x104细胞/ml在2-3天内产生汇合的单层。

1. 在无菌条件下，打开3孔可移除腔室载玻片（ibidi，80381）包装。
2. 像往常一样对细胞进行胰蛋白酶化和计数，MCF-7细胞浓度为3×104细胞/ml。
3. 将1100μl细胞悬浮液加入腔室的每个孔中。避免摇晃，因为这会导致细胞分布不均匀。为获得更均匀的细胞分布，请使用3孔可移除培养专用圆形15mm盖玻片。
4. 用配套的盖子盖住。在37℃和5%CO2下培养
5. 细胞至少培养24小时，或直到建立融合的单层

第二步：

固定是染色程序的第一步。目的是将细胞、细胞结构或组织维持在当前状态，并通过化学试剂在较长时间内保存制剂。

1. 小心地抽吸细胞培养基。
2. 用PBS洗两次。
3. 加入1100μlformalin溶液。
4. 室温下孵育30分钟。
5. 小心地抽吸formalin溶液
6. 用PBS洗涤三次

第三步：

应根据感兴趣的细胞结构选择染色试剂。在该方案中使用DAPI和DYE-490鬼笔环肽染色MCF-7细胞的细胞核和肌动蛋白骨架。
       1.准备你的染色溶液：

• PBS
• DYE-490鬼笔环肽（每单元/玻片，50 µl/单元）
• DAPI 1µg/ml

       2.小心吸出PBS。
       3.用盖玻片拾取工具抓取15毫米的圆形盖玻片，并将其放置在腔室孔内的圆形边缘上。
       4.将移液管尖端插入其中一个角槽中，将150μl染色液移入孔中。
       5.在室温下避光孵育30分钟

第四步：

染色后清洗样本可最大限度地减少背景信号

1. 通过在一个角槽中添加950μl缓冲液来移除盖玻片。
2. 用Coverslip Pick-Up Tool盖玻片拾取工具或镊子抓取漂浮的盖玻片，将其从孔中取出。
3. 如有必要，重复洗涤步骤，抽吸缓冲液并在每孔中移液1100μl缓冲液。圆形的15毫米盖玻片无需额外的洗涤步骤。

第五步：

从一个边缘开始，用手或镊子小心地取下硅胶垫圈。该步骤应以缓慢，稳定的进行，以免损坏细胞层。

第六步：

完成染色程序后，必须在用显微镜成像之前封固样品。该步骤还可防止样品脱水。

1. 将载玻片侧面在干净的实验室湿巾上轻敲，去除样品中多余的杂质。
2. 将封固剂涂在样品上。用24×60毫米的盖玻片覆盖安装好的样品，小心地将盖玻片放到封片剂上，以避免夹住任何气泡。Tip：建议使用硬化封片剂，如FluoroshieldTM (Sigma-Aldrich), Vectashield® (Vector Laboratories Inc.), or ProLong Antifade® (ThermoFisher Scientific)。
3. 等封片剂固定好

第七步：显微观察

使用可移除3孔腔室载玻片培养MCF-7细胞。用DAPI和染料490对细胞结构进行染色。圆形15mm盖玻片减少了所需的染色溶液的量。用硬化封片剂安装载玻片，可使样品长期保存。

图1 MCF-7细胞的肌动蛋白骨架用DYE 490鬼笔肽染色（左上），细胞核用DAPI染色（右上）。下图显示了合成图像，细胞核为蓝色，肌动蛋白骨架为绿色。（比例尺：100µm）

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