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公司新闻/正文
ibidi一体化免疫荧光实验|细胞培养，固定，染色和成像观察--都是在一个小室中完成
510 人阅读发布时间：2023-08-16 10:17
免疫荧光实验
ibidi提供了一种简单且经济高效的方案，使用ibidi3孔可移除腔室载玻片（80381）对细胞进行培养、固定和染色。培养MCF-7细胞并用formalin溶液固定。细胞核用DAPI染色，肌动蛋白骨架用DYE-490鬼笔肽染色。可通过使用圆形的15mm盖玻片来减少所需的染色溶液的量。利用一级和二级抗体染色，通过免疫细胞化学可以探测其他细胞内结构。实验使用的材料：
所使用的材料和试剂如下所示。此外，还需要配备一台有适当滤光片组的倒置或正置荧光显微镜。
- 3孔可移除腔室载玻片（ibidi，80381）
- 3孔可移除培养专用圆形15mm盖玻片及配套工具，（ibidi，10815）
- 细胞：MCF-7（CLS，300273）
- 细胞培养基
- 细胞培养试剂
- PBS
- formalin中性缓冲液，10%（Sigma，HT5001）
- 染色试剂 DAPI（Sigma，D954）DYE-490鬼笔环肽（Dynomics，490-33）
- 封片剂：FluoroshieldTM（Sigma，F6182）
实验方案
细胞培养，固定，染色和成像观察--都是在一个小室中完成。
第一步：
必须在预实验中确定细胞系的正确接种浓度。根据您的细胞类型，用2-6x104细胞/ml在2-3天内产生汇合的单层。- 在无菌条件下，打开3孔可移除腔室载玻片（ibidi，80381）包装。
- 像往常一样对细胞进行胰蛋白酶化和计数，MCF-7细胞浓度为3×104细胞/ml。
- 将1100μl细胞悬浮液加入腔室的每个孔中。避免摇晃，因为这会导致细胞分布不均匀。为获得更均匀的细胞分布，请使用3孔可移除培养专用圆形15mm盖玻片。
- 用配套的盖子盖住。在37℃和5%CO2下培养
- 细胞至少培养24小时，或直到建立融合的单层
第二步：
固定是染色程序的第一步。目的是将细胞、细胞结构或组织维持在当前状态，并通过化学试剂在较长时间内保存制剂。- 小心地抽吸细胞培养基。
- 用PBS洗两次。
- 加入1100μlformalin溶液。
- 室温下孵育30分钟。
- 小心地抽吸formalin溶液
- 用PBS洗涤三次
第三步：
应根据感兴趣的细胞结构选择染色试剂。在该方案中使用DAPI和DYE-490鬼笔环肽染色MCF-7细胞的细胞核和肌动蛋白骨架。1.准备你的染色溶液：
- PBS
- DYE-490鬼笔环肽（每单元/玻片，50 µl/单元）
- DAPI 1µg/ml
3.用盖玻片拾取工具抓取15毫米的圆形盖玻片，并将其放置在腔室孔内的圆形边缘上。
4.将移液管尖端插入其中一个角槽中，将150μl染色液移入孔中。
5.在室温下避光孵育30分钟
第四步：
染色后清洗样本可最大限度地减少背景信号- 通过在一个角槽中添加950μl缓冲液来移除盖玻片。
- 用Coverslip Pick-Up Tool盖玻片拾取工具或镊子抓取漂浮的盖玻片，将其从孔中取出。
- 如有必要，重复洗涤步骤，抽吸缓冲液并在每孔中移液1100μl缓冲液。圆形的15毫米盖玻片无需额外的洗涤步骤。
第五步：
从一个边缘开始，用手或镊子小心地取下硅胶垫圈。该步骤应以缓慢，稳定的进行，以免损坏细胞层。
第六步：
完成染色程序后，必须在用显微镜成像之前封固样品。该步骤还可防止样品脱水。- 将载玻片侧面在干净的实验室湿巾上轻敲，去除样品中多余的杂质。
- 将封固剂涂在样品上。用24×60毫米的盖玻片覆盖安装好的样品，小心地将盖玻片放到封片剂上，以避免夹住任何气泡。Tip：建议使用硬化封片剂，如FluoroshieldTM (Sigma-Aldrich), Vectashield® (Vector Laboratories Inc.), or ProLong Antifade® (ThermoFisher Scientific)。
- 等封片剂固定好
第七步：显微观察
使用可移除3孔腔室载玻片培养MCF-7细胞。用DAPI和染料490对细胞结构进行染色。圆形15mm盖玻片减少了所需的染色溶液的量。用硬化封片剂安装载玻片，可使样品长期保存。
图1 MCF-7细胞的肌动蛋白骨架用DYE 490鬼笔肽染色（左上），细胞核用DAPI染色（右上）。下图显示了合成图像，细胞核为蓝色，肌动蛋白骨架为绿色。（比例尺：100µm）
产品信息
