内皮细胞通过调控血管内皮钙粘蛋白和纽蛋白的内化适应剪切应力和高脂环境

前言

动脉粥样硬化斑块优先发生在血管分叉处的侧壁、分支点和主动脉弓小弯处，这些部位是低剪应力或振荡剪应力的血流再循环部位。血流动力学剪切应力，即血流作用于内皮表面的摩擦力，在动脉粥样硬化的发展中起着至关重要的作用。低剪切应力（<4 dynes/cm2）已被证明会促进动脉粥样硬化，而正常至高剪切应力（> 15 dynes/cm2）可防止人类动脉粥样硬化。血管内皮细胞 (VEC) 通过增加血管舒张剂和抗氧化剂的产生、减少炎症介质和生长因子的表达来响应持续的层流剪切应力。

内皮细胞通过提供血流屏障，在心血管生理学和病理学中发挥着关键作用。在当前的研究中，研究人员研究了促动脉粥样硬化条件下内皮细胞响应剪切应力的表型和屏障功能。

中山大学附属第一医院张教授团队发表题为"Adaptation of endothelial cells to shear stress under atheroprone conditions by modulating internalization of vascular endothelial cadherin and vinculin"的研究论文。揭示了促动脉粥样硬化条件下内皮细胞响应剪切应力的表型和屏障功能。

实验设置

使用胶原酶灌注技术从正常足月新鲜的人脐带中分离人脐带内皮细胞（HUVEC）。实验用四到五代细胞进行。将HUVEC（1×10 5 cells/cm² ）接种到µ-slide 通道载玻片（ibidi，慕尼黑，德国）上以在流动应用之前24小时达到汇合。 使用 ibidi剪切力系统（ibidi，德国）以 5 或 25 dyne/cm² 的恒定LSS产生穿过内皮单层的单向流4小时。将含有培养基通道载玻片和储液器保存在37℃和5%CO ₂ 的培养箱中。为了模拟动脉粥样硬化的情况，将人 oxLDL以 100 µg/mL 的浓度添加到灌注培养基中（静态 + oxLDL 组、5 dyne/cm ² + oxLDL 组、25 dyne/cm ² + oxLDL 组）。无流量和无 oxLDL 条件作为对照（静态组）。

使用涂有纤连蛋白 (10 µg/µL) 的 µ-slide ibiPore 0.5 µm/20% 的通道载玻片（ibidi，德国）与 ibidi 剪切力系统连接，通过测量异硫氰酸荧光素-葡聚糖 (FITC)-葡聚糖通过内皮单层的情况来评估内皮渗透性。 将 HUVEC 接种在多孔膜的下侧并使其生长至汇合单层。 FITC-葡聚糖 (1 mg/mL) 直接添加至下部通道。HUVEC 在下室通道中进行灌注流动培养4 小时，灌注培养基中含有 oxLDL。通过使用 SpectraMax 微孔板荧光计在 490 nm 的激发峰值波长处测量来自每个室的介质的荧光强度，对葡聚糖通过单层到上部通道的被动扩散进行定量。利用不同浓度示踪剂的标准曲线来确定室中 FITC-葡聚糖的浓度。

图1：ibidi 剪切力系统

ibidi流体剪切力系统可以模拟壁剪切应力，这是生物流体系统（包括血管、淋巴管和肾小管）中的流体流动产生的机械力。这些系统支持2D或3D细胞生理环境下长期培养，以分析相关读数，包括细胞形态、行为和生理学。

文章结果表明，oxLDL 刺激和静态条件协同作用，可增强内皮屏障破坏。在相同的oxLDL攻击下，与静态细胞相比，在内皮单层上应用25dyne/cm ² LSS，异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖的通过减少了37.79%，跨内皮电阻（TEER）增加了24.97%（P<0.05），同时细胞间隙形成减少，细胞与基质的粘附相对牢固。与静态细胞相比，同时暴露于层流和oxLDL的内皮细胞具有较少的小FA、较少的单核细胞粘附和迁移，并且减轻了VCAM-1和MCP-1的过度表达。同时，oxLDL诱导的VE-钙粘蛋白和纽蛋白的内化也被层流减弱，并且这种变化在LSS为25dyne/cm ²时比5dyne/cm ²时更明显。

图2：剪切应力影响动脉粥样硬化易发条件下的内皮细胞活力和细胞-基质相互作用。