神经系统体外建模绪论

前言

理解神经系统并非仅仅局限于研究细胞，而是要对生物学中最复杂的系统之一进行解码。神经元构成动态网络，它们通过电信号和化学信号不断进行交流，同时与星形胶质细胞、小胶质细胞及其周围环境相互作用。在实验室中重现这种复杂性颇具挑战，但对于研究神经系统的发展、功能以及疾病而言却至关重要^[1]。

这时，体外模型便派上了用场。它们能让研究人员在简化复杂性的同时，仍能捕捉到关键的生物学行为，从而足以研究特定的机制。随着时间推移，体外模型已从简单的 2D 平面培养体系发展为复杂的 3D 培养体系、类器官以及可控的微环境^[2]。每种模型都揭示了该领域不同层面的信息。

九尺之台，起于垒土：缘何 2D 神经元培养仍至关重要？

2D 神经元培养往往是神经科学研究的起点，这自有其缘由。2D 神经元培养提供了一个干净、可控的环境，能够高精度地观察单个细胞及其行为。在 2D 培养体系中，神经元在平面表面生长，令追踪神经突生长、极化以及突触形成变得轻而易举，为高分辨率荧光成像、钙成像和活细胞分析提供了无,与伦比的光学可及性^[3]，从而使得研究人员能够专注于特定的细胞机制，同时还能进行高度定量化的分析。

图 1：基于人类诱导多能干细胞（hiPSC）构建神经退行性疾病模型的高内涵成像与分析工作流程。

图 1 引自「Menduti, G. and M. Boido, Recent Advances in High-Content Imaging and Analysis in iPSC-Based Modelling of Neurodegenerative Diseases. Int J Mol Sci, 2023. 24(19)」。

如今，2D 神经元培养在自动化成像工作流程中占据核心地位，借助高内涵成像和基于人工智能的分析技术，可对数千个细胞展开分析^[4]。诸如 ibidi μ-Plate 96 孔培养板以及 ibidi μ-Plate 384 孔培养板等为成像优化的培养板，以一致的条件和可靠的光学质量为上述科研场景提供支持，从而为检测细微的表型变化提供了便利。

然而，2D 环境中的神经元仍缺乏天然组织中存在的空间背景和力学信号，而这些因素会影响神经网络的形成、连接方式以及对刺激的反应。尽管如此，2D 培养仍然是神经科学研究至关重要的基础（尤其是在精度和可重复性至关重要的情况下）。

步入高维：3D 神经模型

从 2D 过渡到 3D，改变的不仅仅是几何形态，神经元的行为模式亦随之而变。细胞不再在平面表面铺展生长，而是开始在周围基质中「穿梭」，自行决定在何处生长、连接并稳定其神经网络。这种 3D 环境引入了空间限制、局部浓度梯度以及机械阻力，前述因素均会影响神经元网络随时间的形成与演变。

3D 神经模型营造了一个更为真实的微环境，在此环境中，细胞不仅彼此相互作用，还与周围基质发生交互，从而形成更为复杂的网络结构，促进细胞分化，并表现出更符合生理特征的行为。神经细胞球状体（neural spheroids）便是细胞自我组织形成致密、相互连接结构的典型例子，这种结构能够模拟组织结构的某些特征。

图 2：在经聚赖氨酸包被的玻璃表面上、经视黄酸诱导分化后的小鼠神经干细胞形成神经球体；其中，神经元采用 Tuj1 染色，星形胶质细胞采用 GFAP 染色，则细胞核采用 DAPI 染色。

在 3D 培养体系中，脑类器官代表了更高层次的生物学复杂性。这些体系源自多能干细胞（包括诱导多能干细胞），能够自我组织成类似组织的结构，其中包含多种神经细胞类型，并具有区域特异性特征。借助这些体系，研究人员能够在体外重现人类大脑发育与功能的关键方面，从早期模式形成到神经网络构建，并深入研究神经发育障碍、神经退行性疾病以及影响大脑的病毒感染^[5][6]。

现代 3D 培养体系尤为强大的地方在于，其能够将结构复杂性与可控环境相结合。如 ibidi μ-Plate 96 孔 3D 培养板之类规格明确的培养器具，可在高通量条件下实现可重复的检测实验；而 ibidi μ-Slide 血管生成载玻片则支持以尽可能少的试剂消耗量实现可控的基质胶包埋。

插播：类器官何时开始「思考」？

我们不禁要问：假以时日，类器官究竟能发展得有多复杂？何时这一小团细胞不再仅仅是一个模型，而是开始像神经网络一样运作呢？实际上，脑类器官并不能在有意识的层面上「思考」。但它们却展现出非凡的能力：能产生自发的电活动，形成同步放电模式，并开始构建功能性网络。从某种意义上说，它们虽未「思考」，却已开始彼此「交流」。

这些早期的相互作用为我们提供了一个独特的视角，让我们得以窥见大脑是如何自我构建的。研究人员可以观察信号如何产生、连接如何稳定以及网络行为如何随时间演变。这使类器官成为活体测试模型，让我们能够实时研究功能形成的第一步。

与此同时，类器官也面临诸多挑战——缺乏血管化限制了营养供应和生长，样本间的变异性也会影响实验的可重复性。因此，谨慎操作和维持培养条件稳定对于获得一致且可靠的实验结果至关重要。

由结构至功能：为何微环境至关重要？

构建结构只是问题的一部分。要真正理解神经元的行为，还必须控制其周围的微环境。细胞会对诸如流体流动、浓度梯度以及空间排列等物理和化学信号做出反应，而这些信号会影响神经网络的形成与功能。

在神经系统中，内皮细胞持续暴露于流体流动中，由此产生的剪切应力会影响细胞形态、信号传导以及屏障完整性。在体外实验中，控制流体流动能够助力研究血脑屏障的功能及功能障碍等过程。

图 3：微流控系统中的可控液流会产生剪切应力和浓度梯度，使体外细胞行为及血脑屏障功能更贴近生理状态。

微流控体系可精确控制流体流动、浓度梯度和营养物质的交换，为原本静态的培养体系增添动态条件，从而提高其生理相关性^[7]。ibidi μ-Slide I Luer 3D 通道载玻片与 μ-Slide 细胞球状体灌流培养载玻片之类的微流控芯片可将 3D 细胞培养与可控灌流培养相结合，从而增强实验的可重复性。

μ-Patterning 微区块通过界定神经元的附着位置和连接方式，为神经元模型带来了更高层级的控制。通过引导神经突沿着如线条或限定区域等特定几何形状生长，研究人员能够使神经网络的形成标准化，并构建出可重复的神经元回路，以研究神经连接性、信号传导以及细胞间的相互作用。

图 4：培养于带有线形 μ-Pattern 微区块的 ibidi μ-Slide VI 0.4 六通道载玻片（83614，ibidi）上的人源 RealDRG 模型。在接种细胞前，该载玻片已预先在 37℃ 下用丝蛋白涂层包被 2 h；孵育细胞 72 h 后，用线粒体荧光探针 MitoTracker 及 DAPI 进行固定与染色处理。

上述方法共同作用，将体外模型从静态结构转变为动态系统，在动态系统中，功能源于细胞与其所处环境之间的相互作用。

结语：尺有所短，寸有所长

目前尚不存在单一且完备的神经系统体外模型体系。各类模型所呈现的复杂程度存在差异，其涵盖范围从孤立的细胞作用机制，到类组织结构构建，再到可控的细胞间相互作用，均有涉及。

将不同方法有机结合是关键优势所在：研究伊始可借助 2D 培养体系获取机制层面的深刻见解，随后转向 3D 细胞培养以模拟生理环境，同时引入动态环境因素，进而助力研究人员更全面、深入地理解神经元生物学。

随着这些技术的不断演进，其不仅优化了大脑研究的方法，更拓展了神经科学研究领域的可能性范畴。

参考

1. ^Wu, Y.-Y., et al., Opportunities and challenges for the use of induced pluripotent stem cells in modelling neurodegenerative disease. Open Biology, 2019. 9(1).
2. ^Zhu, H., et al., Recent advances in 3D models of the nervous system for neural regeneration research and drug development. Acta Biomaterialia, 2025. 202: p. 1-26.
3. ^Menduti, G. and M. Boido, Recent Advances in High-Content Imaging and Analysis in iPSC-Based Modelling of Neurodegenerative Diseases. Int J Mol Sci, 2023. 24(19).
4. ^Zehtabian, A., et al., Automated Analysis of Neuronal Morphology in 2D Fluorescence Micrographs through an Unsupervised Semantic Segmentation of Neurons. Neuroscience, 2024. 551: p. 333-344.
5. ^Li, Y., et al., Advances and Applications of Brain Organoids. Neurosci Bull, 2023. 39(11): p. 1703-1716.
6. ^Bose, R., S. Banerjee, and G.L. Dunbar, Modeling Neurological Disorders in 3D Organoids Using Human-Derived Pluripotent Stem Cells. Front Cell Dev Biol, 2021. 9: p. 640212.
7. ^Oddo, A., et al., Advances in Microfluidic Blood-Brain Barrier Models. Trends Biotechnol, 2019. 37(12): p. 1295-1314.