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公司新闻/正文
优化细胞计数的 5 个温馨小贴士
449 人阅读发布时间：2024-09-02 10:54
前言
细胞计数是一项复杂而关键的任务，其准确性对于工业界和学术界的研究进展至关重要。无论是通过手动方式还是自动化手段进行，确保计数的精确性都是必不可少的。为了帮助提升细胞计数的效率，笔者提供了一系列实用的技巧。这些技巧不仅适用于初学者，即使是拥有多年手工计数经验的科研老手，也可能从中发现新的启示。
通过应用这些科学方法，研究人员能够更快速地完成细胞计数工作，并有望从实验中获得更加可靠和高质量的结果。此外，康宁细胞计数仪（Corning 6749）作为一种先进的工具，其高效性和准确性也值得研究人员考虑和采用，以进一步提升实验效率和数据质量。
图 1：康宁细胞计数仪（Corning 4769）
样品制备：千里之行，始于足下
无论实验者选择手动还是自动方法测定细胞浓度，均需确保采用合适的样品以获取精确的数据。不恰当的样本是导致无效计数结果的关键因素之一。为了避免分析不正确的样品，实验者应遵循以下 3 个关键步骤，以提升结果的准确性并减少操作者间的差异：
1）采用标准化实验方案
每位操作人员在进行细胞计数时，均会依据个人习惯采用不同的操作手法，涵盖从胰蛋白酶处理细胞至操作移液器的各个环节。为了提升样品间计数的精确度，需对整个实验设施的操作协议进行标准化，并确保这些协议得到严格且持续的执行（通过定期的性能评估来实现）。
尽管初期可能需要投入时间与精力以确保每位人员均能遵循既定协议，但从长远视角来看，这一举措将显著提升计数的准确性，进而优化实验结果，并为研究过程带来成本效益。
2）将细胞悬液充分混匀
在分析样品时，实验者常假设待测样品中的细胞分布能够代表整个细胞悬液的总体状况。然而，科学实践表明，细胞悬液在静置一段时间后，由于重力的作用，细胞会自然沉降至试管底部，从而在细胞悬液中形成浓度梯度。这一现象直接导致任何未经充分混匀的取样操作均可能无法准确反映悬液的整体特性。
为了克服这一问题，实验者需在采样前采取有效措施以实现细胞的均匀分布。常用的方法包括使用涡旋混合器进行混匀，或采用传统的「轻敲试管法」（即手指轻弹）来重悬细胞。此外，部分操作者在取样时还会选择通过移液管对细胞悬液进行吹打重悬操作。无论采用何种方法，关键在于将其纳入标准的实验流程中，以确保实验结果的可靠性和可重复性。
3）避免产生细胞碎片
在多数计数策略中，存在一定程度的碎片现象是难以避免的。若未进行恰当调整，细胞碎片往往成为导致计数错误的关键因素，具体表现为碎片被错误地识别为细胞（即假阳性现象）或细胞因被误判为碎片而被遗漏（即假阴性现象）。
为提升结果的准确性，实验者需采取相关措施以尽可能地减少样品中的碎片含量，如在重悬细胞时轻柔吹打等。此外，实验者亦可通过优化人工计数训练过程或调整自动检测系统的参数设置，从而减少由碎片引起的计数错误。
4）小结
为了改进样本质量，从而优化实验结果，实验者应将重点放在实验方案的标准化实施上，并力求全面遵循既定方案。这将有助于最大限度地减少样品制备过程中可能产生的误差，并降低不同操作人员之间因操作差异而对结果造成的影响。此外，通过采取有效措施确保样品的均匀性，并有效排除细胞碎片等潜在干扰因素，实验者即能显著提升细胞计数的准确性。
成本折算：实验未动，经费先行
手动细胞计数的流程相对直接：首先收集细胞并进行重悬，随后将样本置于血细胞计数版上，行显微镜镜检，并据此开始细胞计数。这一过程对于具备基本细胞培养技能的人员而言是可行的，作为一种成本效益较高的方法，它能够提供相对精确的细胞计数结果，从而支持后续的科学研究或实验分析。
然而，要准确地进行手动细胞计数，确实需要一定的专业知识和技能。这包括区分活细胞与死细胞、识别细胞团块与细胞碎片的能力，这些都需要长时间的实践和训练来掌握。鉴于手动计数的这些限制，为了提高实验室的效率和准确性，自动细胞计数仪被引入并广泛应用。尽管自动化设备在提升结果一致性和效率方面具有显著优势，但其经济成本也相对较高。
因此，这就引发了一个财务考量：人工细胞计数是否真的比自动计数更经济划算？这需要根据实验室的具体需求、预算限制以及对结果精度的要求来综合评估。
1）如何选择细胞计数策略
无论实验者采用的计数策略为何，均需综合考量以下三个核心成本要素：初始购置成本、运营成本（涵盖耗材等费用）以及人力成本。具体而言，在初始购置成本层面，人工计数以其相对低廉的成本成为目前的一种经济选择。该方案的核心装置包含一块玻璃计数板及一枚计数指针，同时，虽然未直接计入成本，但常规明视野显微镜作为必要的辅助工具，通常被视为实验室基础配备。在运营成本方面，每次测量将消耗一张盖玻片，构成了直接的操作费用。简而言之，人工计数策略在成本上确实表现出色。
然而，当深入比较手动与自动细胞计数仪在总体财务影响上的差异时，可以发现自动计数仪同样具备显著的经济吸引力。这主要体现在对两者操作成本的全面考量上，其中不乏一些值得深入探讨的有趣现象。
图 2：手动和自动细胞计数总成本的表示。两者都包括各自的初始购置成本、运营成本和人力成本。在大约2，600次计数时达到盈亏平衡点。
2）进入自动细胞计数时代
相较于自动细胞计数仪仅需数秒即可完成一次细胞计数，经验丰富的操作员在分析细胞时需耗费至少 4 分钟时间，这一差异显著降低了人力成本，尤其是在面对大量细胞计数任务时，其成本优势更为凸显。
尽管自动细胞计数仪的初期购置成本可能相对较低，但随着细胞计数量的攀升，其投资回报率逐渐显现，这一优势甚至超越了因采用更昂贵耗材而导致的运营成本增加。具体而言，相较于手动计数所使用的标准盖玻片，自动化设置所需的定制一次性细胞计数耗材成本大约高出 15 倍。
综上所述，当综合考虑手动与自动设置的初始购置成本、运营成本及人力成本时，存在一个成本平衡点。超过此点后，手动细胞计数的总成本将因高昂的操作成本而攀升，变得相对昂贵（如图 2 所示）。
3）结语
在评估细胞计数仪时，其初始购置成本固然是考量的关键要素之一。然而，仅聚焦于这一初步投资，可能忽视了长期运行中的潜在成本，进而对实验者造成不必要的经济负担。通过全面分析并整合各系统设置的总成本，包括但不限于购置、运营及人力成本，实验者即可进行更为科学、精确的财务对比，以助于做出更为合理的选择。
因此，笔者建议实验者根据自身具体情况，包括实验需求、环境条件及地理位置等因素，自行开展详尽的成本比较。这样的个性化分析能够确保更准确地识别不同系统（尤其是手动与自动化系统之间）的盈亏平衡点。值得注意的是，在某些特定情境下，盈亏平衡点可能显著不同，甚至在某些案例中，可能根本不存在明确的平衡点。
计算模板：善假于物，可至千里
手动细胞计数的流程相对直接：首先收集细胞，随后进行细胞计数。然而，此过程易受人为因素影响，存在较高的出错风险。例如，初次操作时可能因不当使用移液器而加入过量胰蛋白酶，或是计算失误导致烧瓶内细胞数量偏离预期。此外，实验者的知识储备也可能成为影响准确性的因素之一，并非所有相关知识都能即时且准确无误地应用于实际操作中。
随着实验经验的积累，实验者在细胞计数方面的技能会逐渐提升，变得更加熟练。然而，面对实验中的突发情况，仍需具备灵活应变的能力。例如，当 T-175 培养瓶用尽时，需迅速调整方案，采用 T-25 培养瓶继续实验。此时，就需要了解 T-25 培养瓶的适宜操作容量，以确保实验的顺利进行。
为了辅助实验者更好地应对这些日常挑战，笔者特此提供一份细胞浓度计算模板。该模板包含了各型号培养瓶的基本信息以及一个实用的计算器工具，旨在帮助实验者在需要时快速获取必要信息，提高实验效率。如需下载此模板，请联系本司获取。
计数精度：较之毫厘，精益求精
在评估实验室设备的购买决策时，一个至关重要的考量因素是其准确性。一个核心议题在于如何界定并评估系统的精度。术语“精确（precision）”、“真实（trueness）”及“准确（accuracy）”虽常被提及，但它们各自承载了不同的科学含义，不宜随意互换。
首先，我们需明确这些术语在科学语境下的精确定义。依据ISO 5725等国际标准，“真实度（trueness）”通常指测量结果的算术平均值与公认或理论上的参考值之间的接近程度，反映了测量结果与真实值的符合度。“精确度（precision）”则侧重于多次测量结果之间的一致性，体现了测量的稳定性和可重复性。而“准确度（accuracy）”这一综合性术语，涵盖了真实性与精确度的双重要求。
值得注意的是，“精确度（precision）”一词的历史沿革中，曾一度仅作为“真实度（trueness）”（现多指接近真实值的能力）的一部分被讨论，但现代科学实践中，它更多地被理解为包含了随机误差和系统误差在内的结果总体偏移度的度量。
“偏差（bias）”一词虽在统计学领域有长期应用，但因其可能引发的哲学争议，特别是在医疗和法律等敏感领域，促使“真实度（trueness）”这一术语被特别强调，以正面地表达测量结果无偏、接近真实的状态。
此外，描述重复测量间变异性的标准术语是“精确度（precision）”，它可通过标准偏差等统计量进行量化。为全面评估测量的可变性，通常需考虑两个精度条件：重复性和再现性，这两者在多种实际应用场景中对于描述样品特性的变异性至关重要。
综上所述，仅当实验室设备展现出高度的测量准确度和精确度时，方能确保产生可靠且准确的数据结果。
1）如何衡量细胞计数仪的真实度（trueness）？
细胞计数仪的真实度被科学定义为设备所测量的计算平均值与实际细胞浓度之间的接近程度。为了验证这一准确性，必须采用该设备对已知浓度的样品进行分析。
此外，重要的是要认识到细胞计数器在其工作浓度范围的边界条件下可能表现出不同的性能。基于这一认识，通过逐步稀释已知浓度的样品，可以执行一项基础的真实性评估测试，进而构建一条校准曲线。此曲线旨在全面反映细胞计数仪在整个操作浓度范围内的真实性，而非仅限于某一特定浓度点。
一个高精度的细胞计数器的校准曲线将展现出以下两个关键特征：一是测量浓度与理论浓度之间呈现出良好的线性关系；二是曲线的斜率接近于1，这进一步印证了设备的高准确性。
图 3：高精度与高真实度紧密相关，二者共同决定了系统的准确度。
2）如何衡量细胞计数仪的精确度（precision）？
接下来，笔者将阐述如何衡量细胞计数仪的精确度。如先前所述，细胞计数仪的精确度是衡量其系统稳健性的关键指标。这意味着，在实验者针对同一样本进行多次计数操作时，应能够获得具有高度一致性的结果。
从统计学的视角出发，这种一致性或精确度的量化可以通过变异系数（Coefficient of Variation, CV）来表征。实测变异系数可通过以下公式计算得出，其中 σ
代表标准差，而 x 拔则代表数据集的平均值：
代表标准差，而 x 拔则代表数据集的平均值：
计算得到的实测变异系数应始终与其理论变异系数进行比较，理论变异系数可通过以下公式计算得出，其中 n 代表数据集中包含的个案数：
理论变异系数是实测变异系数的参考值，用于衡量仪器的精确度（precision）。实测变异系数应与理论值相近，但不应低于理论值。实测变异系数会更高，这主要是由于除了理论变异系数所涵盖的变异性外，还额外包含了由系统因素和操作者操作差异所引入的误差，这些误差会进一步导致标准偏差的增大。
3）结语
高精度与高真实度紧密相关，二者共同决定了细胞计数仪的准确度。基于这些信息，实验者能够有效评估制造商提供的数据，并独立测试系统性能。
为评估设备的真实性，应绘制校准曲线。高真实度的细胞计数仪应展现出实测浓度与理论浓度之间的紧密线性相关性。
至于精确性的衡量，实验者应查阅系统制造商提供的变异系数值，并将其与理论变异系数值进行对比分析——实测变异系数应与理论值相近，但不应低于理论值。
改变策略：告别「瞪大眼」，迎来光与电
在探讨自动细胞计数仪与人工细胞计数方法的优劣时，实验者往往持有明确的偏好。为科学且公正地审视此议题，首要之务是明确研究目的：即具体需对何种对象进行计数分析。
该问题的答案将直接指导选择何种计数方式更为适宜。实验者可能旨在频繁监测某一特定细胞类型的数量变化，或致力于探究多种细胞及细菌群体的特征。在手动与自动计数方法之间做出抉择时，无论具体计数目标为何，均需综合考量以下四个关键因素：
1）成本
手动细胞计数因其可重复使用的特性，在初始购买与运营阶段呈现出最低的成本效益，尤其适用于小规模的计数任务，是预算敏感型项目的优选方案（详见本文第三节）。
然而，值得注意的是，此方案未纳入操作人员的时间投入成本，以及积累人工计数经验所需的时间消耗，这些因素在计数量增大时将显著推高总成本。
相较于手动计数，自动细胞计数仪的初期购置成本可能构成显著障碍，因其价格往往高出手动设备多个数量级。但其核心优势在于能极大缩短单个样品的处理时间，提升工作效率。此外，自动设备的使用还伴随着对特定消耗品的需求，这构成了一项额外成本。
当设备应用于大规模细胞计数时，消耗品的持续需求可能会逐渐超过其初始购置成本。然而，随着计数量的持续增长，自动化系统的总成本可能会逐渐低于人工计数，这主要得益于其有效削减了人力成本，从而实现了成本效益的优化。
2）准确度
无论是手动还是自动设置，所获取的结果均需保证高度的准确性。手动细胞计数的主要优势体现在其多功能性、精确的分类能力以及早期问题检测的效率上。由于操作人员直接观测细胞，因此能够迅速识别并评估潜在的误差。
然而，手动操作亦有其局限性，主要在于结果的主观性以及操作者间可能存在的显著差异。不同操作者即便使用同一血细胞计数器对相同网格进行计数，其方案与结果也可能大相径庭。
相较之下，自动细胞计数展现出低误差率的显著优势，且能有效避免人工计数带来的主观性偏差。其自动化特性还赋予了高再现率的特点，即多次测量间的一致性较高。
但值得注意的是，自动系统虽精确执行既定程序，却可能在无人为干预的细胞分类过程中，出现较高的错误分类风险。这一特性虽确保了系统的稳定性，却可能在一定程度上低估了实际的细胞密度，从而影响了结果的精确度。
3）广泛适用性
手动细胞计数因其灵活适应性而广泛应用于多种场景，然而，其操作效能受限于操作人员的熟练程度及所需的时间投入，这些均是对执行准确计数的关键因素。
自动细胞计数则显著提升了样品处理效率，使得大规模计数成为可能，进而促进了生产率的提升并减少了细胞亚群间的错误分类风险。然而，这一方法在某些特定系统中的应用范围可能受到一定限制。
4）报告
自19世纪首台血细胞计数仪问世以来，手动细胞计数的报告方式基本维持原状，主要依赖于操作员在实验室记录簿中手动记录结果。
相较于此，自动化细胞计数领域则经历了显著的变革，极大地促进了报告的深度与速度。当前的自动化设置不仅能够生成包含详尽细胞计数信息的分析报告，还能提供计数细胞的直观图形展示，从而增强了数据的可视化效果。进一步地，借助云数据存储技术，用户能够在未来任意时间点重新访问并深入分析这些数据，这一特性有可能揭示出先前被忽视的新发现或趋势。
5）结语
在抉择采用自动或手动细胞计数方法之前，首要任务是明确待计数的细胞类型及其数量需求。唯有清晰界定这些要素，方能准确评估适用于特定情境的仪器设备。随后，应细致考察手动与自动系统的各项特性，包括但不限于成本效益、准确度、广泛适用性、生成报告，以及这些特性如何契合实际需求。
通过将这些系统特性与实验者的具体情况相结合，进行综合分析，实验者将能够精准判断哪种系统更能满足自身需求，进而作出科学合理的决策，即继续使用手动计数方式或转而采用自动计数系统。