广州科适特科学仪器有限公司
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公司新闻/正文
Corning Videodrop 康宁纳米分析仪按照标准方案用于快速表征细胞外囊泡
人阅读 发布时间:2024-03-29 16:38
一、摘要
细胞外囊泡(EVs)最近的兴趣增长是由这些细胞衍生的膜纳米颗粒在治疗效果方面的潜力决定的。电动汽车科学目前已明显实现了广泛发展,电动汽车出版物的不断增长证明了这一点,证实了电动汽车在衰老、癌症、传染病等各种生理途径中的重要作用。
因此,在进行临床翻译之前,迫切需要两种分析/表征技术。到目前为止,通过可调电阻式脉冲传感(TRPS)实现了EVs的定量和定标,这是一种相对耗时的复杂方法。
法国米里亚德公司(Myriade)开发了Videodrop,这是一种基于干涉光学显微镜(ILM)的新方法,可在单个液滴中快速轻松地表征纳米粒子。我们在从血清和生物液体中分离的EVs上比较了这两种EVs表征方法:ILM法和TRPS法。两种方法之间的相关性似乎是稳健的,R值较高。这些结果表明,Videodrop可作为EVs快速定性的相关工具,用于研究EVs在生理学和病理学中的作用。它是一种易于使用和快速的替代标准更复杂和耗时的方法。
二、介绍
EVs是细胞衍生的纳米颗粒,在30至1000nm之间,在细胞外介质中释放。它们代表了一种生理的细胞间通讯模式,无论是局部的还是区域性的,贯穿始终器官1(图1)。因此,EVs能够将蛋白质、核酸和脂质等生物活性物质从供体细胞转运到其附近和远处的受体细胞。除了在健康和疾病的细胞间通信中的基本作用外,EVs还显示出克服困难的生物屏障和免疫防御的优势,使其成为癌症以及代谢、自身免疫,以及再生医学和病原体接种。由于EVs在体液(血浆、尿液、母乳……)中含量丰富且稳定,因此它们已成为评估健康状况以及病理情况下对治疗结果的反应的有前景的生物标志物。由于EVs为纳米尺寸物体,因此EV研究需要先进技术和专业知识来评估其作为生物标志物的特异性和敏感性,以及作为治疗工具的有效性和安全性。
图1.EVs的生物发生、组成和形态。
(A)示意性表示:通过细胞膜出芽或多囊内体(MVE)膜融合,每个细胞实际上都释放了EVs。这些生物纳米粒子的大小高度不均匀,分为两种亚型:小型EVs(大小< 200 nm)和大型EVs(大小> 200 nm)。
(B)由大量但特异的蛋白质、核酸和脂质组成,EVs充当信息载体,从供体至靶细胞,从而调节其生物学。
(C)通过冷冻电子显微镜观察到的血浆性EVs。
在此背景下,由Julie Gavard博士(CRCINA,Inserm,CNRS,法国南特大学)领导的学术研究团队SOAP(癌基因发生、血管生成和通透性中的信号传递)实验室正在探索EVs作为被劫持的通信工具在原发性恶性脑肿瘤2-4中的作用。为此,从血浆样本和尿液样本中分离出EVs,并使用qNano技术(Izon Science)通过可调电阻脉冲传感(TRPS)进行定量分析。然而,需要一种快速、可靠的EV定量新方法,该方法应与大量患者样本分析兼容,且液体活组织检查体积有限。
法国米里亚德干涉光学显微镜公司(ILM)基于ILM开发了一种新的检测溶液中纳米粒子的方法Videodrop。Videodrop可实时测量单个样本液滴中纳米粒子的浓度和大小。该方法的相关性在于其简单性:测量无需标记、无需过滤、无破坏性、快速,且只需要5至10 L样本体积。因此,该技术特别适用于电动汽车的特性描述。
在此,我们通过Videodrop和qNano (Izon Science,NZ)比较了EVs的定量(最近称为膀胱血过多症5),这是一种成熟的EVs表征方法与血清和生物液体分离。在表明Videodrop适合于快速定量EVs之后,我们应用这项新技术进行了简单的稳定性研究,以确定EVs样本的最佳储存条件。
三、材料与方法
电动汽车隔离
使用与自动馏分收集器(Izon Science)相关的70 nm(原装)qEV色谱柱,通过大小排阻色谱法(SEC)从血浆或尿液中分离出EVs(图2)。Videodrop和qNano分析均在新鲜的EV制剂上进行。
图2.来自患者的EVs的纯化过程和定量健康者的献血。
干涉光学显微镜(ILM)
Videodrop是一款定制显微镜,利用干涉现象检测溶液中单个纳米粒子散射的光。Videodrop录制的视频经过处理后,可显示由在光路中移动的纳米粒子。使用此干涉信号,可自动检测和跟踪纳米粒子,以计算浓度和流体动力学直径。计数粒子可以测量浓度,而跟踪它们的布朗运动可以测量它们的流体动力学直径。显微镜的放大率和照相机的速度允许以更少的时间执行小样本体积(低至5 L)的分析超过一分钟。
该仪器基本上基于显微镜,因此可以观察到微米范围内的物体,观察方式与传统显微镜相似,因此也可以评估样本成分(即大型或小型EVs)。这种通过干涉检测纳米粒子的创新方法允许在没有眩光或堵塞的情况下分析尺寸多分散样本。图3显示了50至400 nm(中位值200nm)EVs有限斑点的衍射。
图3.EVs图像采用ILM (A)纳米图像获得,可检测和跟踪EVs的衍射图案,以计算浓度和流体动力直径。(B)来自跟踪颗粒数据的EVs粒径分布直方图。
为了优化操作员间的可变性,制定了一个标准方案(表1)。
可调电阻式脉冲传感(TRPS)
qNano是一种基于可调电阻式脉冲传感(TRPS)的设备。它基于库尔特原理,即当施加电流时,颗粒被拉过孔隙,产生与穿过孔隙的颗粒体积成比例的阻抗变化。样本在0.22 m过滤PBS中稀释(1/4)后,使用NP100纳米孔(Izon Science)进行分析。测量是在35 L体积的稀释样本上进行的。
稳定性研究
为了确定标准方案的储存条件,在不同温度下进行了为期三周的样品稳定性研究。从一个生物样品中制备EVs,并储存在+4摄氏度、摄氏零下20度和摄氏零下80度。两周和三周后进行浓度测量。Videodrop用于评估血浆EV的稳定性,通过跟踪储存前后EV的数量。
结果与讨论
EVs被研究它们转移生物活性成分的能力和它们在细胞间通讯中的生理/病理功能6。除了它们在跨细胞信息传递中的工具性作用外,EVs可能在数量和质量上随性别、年龄和疾病而变化5.7。因此,EVs可能代表健康状况和疾病进展的有价值的信息资源。
循环EVs的浓度可以通过微创液体活检获得,目前在各种疾病中进行了研究。在建立了从临床样本中分离EV的严格、可重复的方法后,研究人员现在需要一种准确、快速的大批量样本表征方法。
表1.开发的标准方案说明:示例,三次系统稀释和原始浓度计算对应于两个线性值的平均值。
纳米粒子浓度
使用SEC从6份血浆样本和4份尿液样本中分离出EVs,并在分离后和储存前进行分析。ILM使用Videodrop并遵循标准方案,TRPS使用qNano评估膀胱血症。Videodrop和qNano在EV浓度方面呈线性相关性(相关系数R2 = 0.95)(图4)。
图4.Videodrop和qNano定量方法的比较
从生物液体中提取的EVs(血浆n=6,尿n=4
纳米粒子的尺寸分布
Videodrop提供溶液中纳米粒子的浓度和大小信息。每个检测到的纳米粒子的大小都是通过计算其轨迹获得的。因此,尺寸结果可用于EVs表征。图5A显示了通过Videodrop测量的代表性血浆或尿液样本中的EVs特征。图5B显示了几个样本的平均值,表明从血浆和尿液样本中分离出的EVs的大小和分布存在差异。从尿液中分离出的EVs似乎显示出比从血浆中分离出的EVs更高的流体动力学直径。
图5.通过Videodrop比较血浆和尿液样本中的EVs大小。
贮藏条件
EVs的稳定性和储存条件(温度和储存时间)一直是生物学家面临的挑战。生物样本中的EVs需要长期储存,研究人员应能够在储存后确认样本的可比性。
图6.2周和3周后在4℃下储存稳定性,2周后在-20℃和-80℃下储存稳定性
在本稳定性研究中,在+4℃下储存3周后以及在-80℃下储存2周后,EV部分的损失小于20%。然而,在-20℃储存后,EVs不再可通过Videodrop测量(图6)。这可能是由于EVs的完整性丧失。基于此数据,应优先储存EVs,并在-80℃冷冻后通过Videodrop定量。
四、结论
在本比较研究中,平行使用Videodrop和qNano技术对从10名受试者采集的血浆和尿EVs进行定量。通过为Videodrop开发严格且可再现的测量方案,可以获得可靠的大小和浓度值。Videodrop获得的EV浓度结果与TRPS的结果(qNano)相关性良好,相关系数R2 = 0.95。
Videodrop可进一步区分两类EVs人群(血浆和尿液)之间的大小差异。Videodrop可用作快速表征EVs样本量的工具。
无论是在基础研究和转化研究中,还是在临床试验中,都非常需要进行系统标准化,以更好地评估EVs的浓度。在这种情况下
Videodrop特别适合于满足EVs作为非侵入性生物标志物表征的前提条件。因此,这种需要最少样本量的快速实时滴定方法适用于EV定量。
五、参考
1. Théry C, et al. Minimal information for studies of extracellularISEV2018): a position statement of the International Society for
Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal
of Extracellular Vesicles. 2018;7(1):1535750.
2. Treps L, et al. Extracellular vesicle-transported Semaphorin3A
promotes vascular permeability in glioblastoma. Oncogene. May
2016;35(20):2615‑23.
3. André-Grégoire G, Bidère N, Gavard J. Temozolomide affects
Extracellular Vesicles Released by Glioblastoma Cells. Biochimie. 1 Dec
2018;155:11‑5.
4. Treps L, et al. Glioblastoma stem-like cells secrete the pro-angiogenic
VEGF-A factor in extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles.
1 Dec 2017;6(1):1359479.
5. Sabbagh Q, et al. Vesiclemia: counting on extracellular vesicles for
glioblastoma patients. Oncogene. 2020;39(38):6043‑52.
6. Van Niel G, D’Angelo G, Raposo G. Shedding light on the cell biology
of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. April
2018;19(4):213‑28.
7. André-Grégoire G, Gavard J. Spitting out the demons: Extracellular
vesicles in glioblastoma. Cell Adhesion & Migration. 4 March
2017;11(2):164‑72.
六、产品介绍:Corning® Videodrop(纳米分析仪)一种实时工具,用于测量一滴中纳米粒子的大小和浓度
1、简介
Corning Videodrop利用干涉测量原理和显微镜技术,实时感知、检测、表征和跟踪单个纳米粒子。这款生物制品分析设备的操作非常流畅,这得益于其直观的软件界面和高效的样品处理方案。将一份5至10微升的滴剂放在磁性样本架内的专用Videodrop载玻片上。操作员通过提升手柄和降低样本保护罩,为分析做好准备。预览模式确认蓝色发光二极管饱和度在参数范围内。技术人员选择“记录”以启动生物生产批次的纳米粒子浓度和布朗运动的实时分析。清洁使用浸有经认证的清洁剂的实验室不含棉绒擦拭布(KimberlyClark)溶液进行清洁,来吸收载玻片和物镜上的液滴。在检测到所需数量的粒子后,可立即查看和导出数据。
由于在80-500纳米范围内收集病毒载体(如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和细胞外囊泡(EVs)的物理滴度的相关性,Videodrop设备与生物制品市场的细胞和基因治疗细分市场保持一致。与p24 ELISA、RT-qPCR和NTA检测相比,Videodrop的输出是线性的(图1)。该装置能够从纳米级视图切换到10um以内的微观视图,以查看碎片和聚集体中的杂质。审计追踪软件扩展将允许用户在符合GMP设施要求的操作过程中跟踪软件界面中发生的操作。康宁员工将在采购时安装和调试设备。为期12个月的服务合同是可选的,包括1年的预防性维护。康宁Videodrop体积小、使用方便、处理速度快,是表征纳米颗粒的理想工具,旨在加快药物、细胞和基因治疗的临床试验以及疫苗生产。
2、特征
◗ 速度低于1分钟
– 滴液
– 处理
– 清洁
◗ 不需要校准或清洗
◗ 可重复和再现
– 无操作员间偏差
– 无参数调整
3、参数
生物纳米粒子尺寸(流体动力学直径) |
80至500纳米 |
纳米粒子浓度范围 |
1.108至1.1010 份/毫升(part./mL) |
最低系统要求 |
◗ Windows 10或11 电脑 ◗ 16 GB内存 ◗ 存储容量至少为4tb(TB)的硬盘 ◗ 处理器至少有8个内核(最少每个内核3.6至5 GHz的频率) ◗ USB SS端口可用 |
电压选择 |
◗ 120V,60 Hz,30 VA ◗ 230V,50 Hz,30 VA |
外部电源(张力、功率、容差) |
12V,36 W,±10% |
重量 |
39.69 磅 (18公斤) |
材料 |
涂漆铝 |
尺寸(长x宽x高) |
11.82x11.82x31.15 英寸(30x30x79.1 厘米) |
最大光输出功率 |
4.5瓦 |
光波长 |
450 nm |
光学风险组 |
3(根据 EN 62471) |
工作温度 |
2℃ 至 40℃ |
工作湿度 |
30%至75%相对湿度(非冷凝) |
储存和运输温度 |
-20℃ 至 60℃ |
储存和运输湿度 |
30%至85%相对湿度(非冷凝) |
图1.慢病毒载体定量方法比较
(A)p24 ELISA法与Videodrop滴度测定法的比较
(B)RT-qPCR与Videodrop滴度的比较
(C)NTA和Videodrop titers的比较
4、订购须知
Corning Videodrop设备
货号 |
描述 |
数量/Cs |
VD-1000 |
用于表征纳米粒子的视频滴设备 |
1 |
配件
货号 |
描述 |
数量/Cs |
VD-1000-AT |
Videodrop审计跟踪 |
1 |
VD-1000-GS |
Videodrop载玻片 |
50 |
VD-1000-SH |
Videodrop样本架 |
1 |
VD-1000-PC |
Videodrop保护罩 |
1 |
VD-1000-LPC |
发光二极管保护罩 |
1 |
服务
货号 |
描述 |
VD-1000-SC |
Videodrop服务合同(12个月) |
VD-1000-PM |
Videodrop预防性维护 |