这是在µ-Slide Chemotaxis细胞趋化载玻片中进行3D趋化性实验后，对嵌入Matrigel®中的HUVEC（人脐静脉内皮细胞）进行免疫荧光染色的详细实验方案。在Matrigel®中，趋化性细胞向10％FCS迁移之后，通过免疫细胞化学染色研究了定向细胞迁移的形态学特征。

一、实验材料准备

二、实验步骤

将HUVEC接种在50％Matrigel®中，并填充至µ-Slide Chemotaxis中，然后将其沿10％FCS梯度迁移24小时。利用免疫染色研究了Matrigel®定向迁移后内皮细胞的形态特征。HUVEC的染色是直接在µ-Slide趋化载玻片中进行。在染色方案的所有步骤中，将60 µl的相应溶液分别添加到两个大容器中。在孵育过程中，所有塞子均保持关闭状态，以免干扰通过观察通道的扩散。除非另有说明，否则所有步骤均在室温下进行。


1）从一边的储液池中取出塞子，然后吸出培养基。在抽吸和冲洗步骤中，将塞子留在中央通道中。
2）用1x PBS洗涤→3x 10分钟。
3）用4%多聚甲醛固定细胞和基质蛋白→1x 40分钟。
4）用1x PBS洗涤→2× 10分钟。
5）用0.2%Triton X-100/PBS透化细胞→1x 20分钟。
6）用1x PBS洗涤→6x 10分钟。
7）用1% BSA/PBS阻断非特异性抗原→过夜。
8）用1x PBS洗涤→6x 10分钟。
9）添加一抗：单克隆抗VE钙黏着蛋白，小鼠（在1%BSA/PBS中为1：100）→在4℃下1x 24小时。
10）用1x PBS洗涤→6x 10分钟。
11）添加二抗：山羊抗小鼠lgG（H+L），Alexa Fluor 680（在1％BSA / PBS中为1:50）→在4℃过夜。
12）用1x PBS洗涤→6x 10分钟。
13）加入染色混合物→1x 40分钟。
i）罗丹明phalloidin染色肌动蛋白丝（PBS中1：400）
ii） Hoechst 33342对细胞核染色（1：100，PBS中0.5 µg/ml）
14）用1x PBS洗涤→6x 10分钟
15）将最后的PBS留在储液罐中并开始成像。

免疫荧光图像由LeicaSP8SMD共聚焦激光扫描显微镜获得，配备63xHCPLAPO1.2NA水物镜。用405nm紫外激光激发Hoechst 33342，594nmHeNe激光激发罗丹明-phalloidin，638nmHeNe激光激发AlexaFluor680。
重要注意：与标准染色方案相比，洗涤和染色步骤所需的潜伏时间更长。这是为了确保抗体通过凝胶的充分扩散。
 

三、结果

HUVEC在Matrigel®基质中的免疫染色显示，相邻的细胞组优先形成细胞簇，并作为集合体迁移。观察到一些细胞以单个迁移。

图1：在50％Matrigel®中显示HUVEC多细胞趋化性的细胞簇。固定后，对细胞进行细胞核染色（蓝色），F-肌动蛋白（红色）和VE-钙粘蛋白（青色）。白色箭头表示VE介导的细胞间接触。
 

当细胞作为个体迁移时，细胞体被拉长，呈间充质梭形。细胞呈前后极性，前缘呈小片状，向梯度方向有突起。

当以多细胞单元组织时，细胞团簇表现出明显的前后不对称的群极化（图1）。在这里，一个或几个前导细胞参与了前缘的形成，前缘表现出细长的突起或宽的片层。迁移复合体较深区域的连续细胞没有极化。然而，这些细胞特征性地保留了VE钙粘蛋白介导的细胞-细胞接触（图1）。