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广州科适特科学仪器有限公司

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实验室仪器 / 设备、耗材、细胞库 / 细胞培养、试剂
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在单向流体环境下进行细胞培养粘附实验方案

人阅读发布时间：2023-07-31 09:43

该应用描述了一种在流动下的细胞粘附试验，该试验旨在研究特定细胞表面分子的作用，以确定它们在细胞附着和粘附到其他细胞类型期间的潜在相互作用。

对于我们的方法，我们使用预染色的鼠肿瘤细胞（多发性骨髓瘤：MM）和鼠内皮细胞（EC），然后使用单克隆抗体阻断我们感兴趣的分子之一。简而言之，将 EC 接种到 ibidi μ-Slides I0.6mm Luer 中，并在单向恒流下培养 24 小时。为了开始共培养，将标记的 MM 细胞添加到流动容器中继续流动。24 小时后，用抗体（以阻断感兴趣的分子）或相应的同种型对照处理装置，并保持流动24 小时。第二天，将μ-Slides 与流体单元 (FU) 断开并清洗以去除非粘附的 MM 细胞。为了分析标记的 MM 细胞对 EC 的粘附，使用共聚焦显微镜获得了μ-Slides的荧光图像。

流动细胞培养

1. 材料和试剂

•MOPC 多发性骨髓瘤 (MM) 细胞系 (ATCC, TIB-23™)

•EOMA 内皮细胞 (EC) 系 (ATCC, CRL-2586™)

•含 10% FCS 的 RPMI 培养基（Fisher Scientific，11530586）

•内皮细胞生长培养基（EC 培养基、CellBiologics、M1168）

•PBS（泛生物技术，P04-361000）

•非酶细胞解离溶液（Sigma-Aldrich，C5914-100ML）

•台盼蓝溶液（Sigma-Aldrich，93595）

•CellTracker™绿色 CMFDA 染料（ThermoFisher，C7025）

2. 设备和设置

•带有 2 个流体单元 (FU) 的 ibidi 泵系统，每个单元都带有用于 2 ml 储液罐的支架（ibidi，10977）

•ibidi μ-Slide I0.6mm Luer， ibiTreat （ibidi， 80186）

•ibidi Perfusion Set 蓝色，15 厘米，内径 0.8 毫米（ibidi，10961）

•ibidi 过滤器/储液罐套装，2 毫升（ibidi，10972）

•带细胞培养设备的层流罩

•培养箱（所有培养步骤均在 37°C 和 5% CO2 下进行）

•带有适当滤光片组和照相机的荧光显微镜

•粘度：0.0072 (dyn x s) /cm²

3.实验流程

1.准备EOMA细胞稀释液：根据制造商的说明，使用非酶细胞解离溶液分离先前培养的EOMA 细胞。使用血细胞计数器（corning细胞计数仪）对细胞进行计数。在 EC 培养基中将细胞稀释至 1.2x106个细胞/ml 的浓度。

康宁细胞计数仪 (Corning Cat. No. 6749)一种基于云的自动化细胞计数仪，它利用现代光学技术与图像分析算法，将手动细胞计数的最佳品质融入到基于图像的自动对焦细胞计数中，以满足客户的需求。

2.种入EOMA 细胞：在 3个 µ-Slides I0.6mm Luer 中加入 150 µl EOMA 细胞稀释液（每个 µ-Slide 1.75x105EOMA 细胞），然后孵育 3 小时。

表1：实验设置

3.启动流量：播种三小时后，将 2个 µ-Slides 连接到流体单元FU，使用总量2.7 毫升 EC 培养基。在8.2 mbar 的压力下将 EOMA 细胞表面的剪切应力设置为 0.5 dyn/cm²。测量流速并使用两个 FU 的平均值来计算校准因子。提前孵育 FU 和连接的载玻片过夜。第三个带有 EOMA 细胞的 µ-Slide 用作静态控制。在没有任何流动的情况下孵育它过夜。

4.准备MM细胞：根据制造商的方案，用 Cell Tracker Green (CMFDA) 染料在600 µl RPMI 培养基（不含 FCS）中染色6x105MM 细胞。标记后，离心细胞并使用血细胞计数器对其进行计数。

5.开始与MM细胞共培养：停止流动并在无菌条件下从 FU 水库中取出 EC 培养基。要开始共培养，将 RPMI 培养基（含 10% FCS）和 EC 培养基以 1:1 的比例混合，并填充该混合物总体积为 2.5 ml ，其中含有1.5 x105MM 注入两个 FU 储液罐。将 FU 重新连接到泵系统并继续流动 24 小时。