本应用介绍了使用 ibidi µ-Slide 18 孔载玻片培养，固定和染色贴壁细胞的简单方案。在此示例中，我们培养了人内皮细胞，用 paraformaldehyde 固定了它们，并对 F-actin 细胞骨架和表达α- 微管蛋白的微管进行了染色。细胞核用 DAPI 复染。

该应用四个主要步骤：

 

在本应用中，使用了以下材料：

材料	制造商	目录编号
µ-Slide 18 孔载玻片 ibiTreat	伊比迪	81816
胡韦克	各种	各种
4％paraformaldehyde	西格玛奥德里奇	HT5011
0.1％Triton®X-100（在 PBS 中稀释）	阿尔法·埃萨（Alfa Aesar）	A16046
1％ 牛血清白蛋白（在 PBS 中稀释）	西格玛奥德里奇	A1470
LifeAct-TagGFP2 蛋白	伊比迪	60112
单克隆抗 α-Tubulin 抗体，小鼠	西格玛奥德里奇	T5168
抗小鼠 IgG-Atto594	西格玛奥德里奇	76085
具有 DAPI 的 ibidi 安装介质	伊比迪	50011
可选：ibidi 浸油	伊比迪	50101

  荧光显微镜（倒置），带有合适的滤光片组

1. 培养

· 在无菌条件下打开 ibidi µ-Slide 18 孔载玻片 ibiTreat（＃81816）的包装，并将其放在 µ-Slide 机架（ibidi＃80003）上。

· 准备细胞悬液（1 x 105 细胞/ ml），并在 µ-Slide 18 孔载玻片每个孔中加入 100 µl。

· 用提供的盖子盖上腔室。

· 在潮湿的细胞培养箱（37°C，5％CO2）中培养过夜。对于更长的细胞培养，我们建议几天后进行中等程度的交换。

2. 固定，渗透和封闭

· 使用细胞培养抽吸装置从孔中抽吸细胞培养基。

· 用 Dulbecco PBS 冲洗细胞，方法是将 100 µl 缓慢加入每个孔。

· 用约 100 µl 4％paraformaldehyde 固定细胞 20 分钟。

· 用 PBS 冲洗细胞两次，方法是将 100 µl 缓慢加入每个孔中。

· 除去液体，并在 PBS 中加入约 100 µl 的 0.1％Triton®X-100。孵育 10 分钟。

· 用 PBS 洗涤细胞,缓慢将 100 µl 加入每个孔中。

· 除去液体，并在 PBS 中加入 100 µl 1％BSA 封闭溶液。孵育 20 分钟。

· 用 PBS 洗涤细胞,缓慢将 100 µl 加入每个孔中。

3. 染色

· 准备您的染色和抗体溶液。

· 使用细胞培养抽吸装置从孔中除去液体。

· 将 100μl 用 PBS 稀释的一抗（抗-Tubulin 1：1000）稀释到每个孔中，并在 4°C 下孵育过夜。

· 用 PBS 洗涤细胞一次，持续 10 分钟。

· 将在 PBS 中稀释的 100 µl 二级抗体混合物（抗小鼠 IgG-Atto594 1：500 和 LifeAct-TagGFP2 蛋白 30 µg / ml）稀释到每个孔中，并在室温下于黑暗中孵育 3 小时。

· 用 PBS 洗涤细胞两次，每次 10 分钟。

· 吸出 PBS，并在每个孔中加入约 100 µl 含 DAPI 的 ibidi 封固剂。使用滴管瓶滴加安装介质。

4. 显微镜观察

· 在荧光显微镜下用合适的滤光片组观察细胞，并可选择用 ibidi 浸油（＃50101）观察细胞。

· （可选）覆盖图像以创建合并图像。

5. 结果

接种在 µ-Slide 18 孔载玻片 ibiTreat 中，物镜 60x，油浸后 24 小时后的 HUVEC（人脐静脉内皮细胞）。

绿色：F-肌动蛋白（LifeAct-TagGFP2 蛋白）

红色：微管蛋白（单克隆抗 α-Tubulin 抗体，小鼠+抗小鼠 IgG-Atto594）蓝色：核仁（使用具有 DAPI 的 ibidi Mounting Medium 进行 DAPI 染色）

在本应用中使用的 ibidi µ-Slide 18 孔载玻片带有 18 个孔的小室盖玻片，用于细胞培养，免疫荧光和高端显微镜检查，它具有以下特点：

• 多合一 18 孔腔载玻片，用的细胞数量少，试剂量少的经济高效实验
• 显微镜载玻片非常适合通过最高光学质量的 1.5 号聚合物盖玻片底部进行高分辨率成像
• 适用于各种显微镜技术（例如 DIC，宽场荧光，共聚焦显微镜，双光子显微镜，FRAP，FRET，FLIM和  LSFM）的细胞培养室