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技术资料/正文
Axygen® 爱思进BL凝胶成像系统具有紫外线和蓝光功能，可与溴化乙锭和其他安全染料一起使用
733 人阅读发布时间：2021-07-14 10:14
介绍
Axygen 凝胶成像系统-BL（产品货号：GDBL-1000）是一种易于使用的凝胶图像捕获系统，可使用 302 nm 波长紫外光 (UV 302) 生成高质量的16位TIFF图像)、365 nm 波长紫外光 (UV 365)、470 nm 蓝光或 Epi 白光。蓝色光源可以使用溴化乙锭替代染料，避免紫外线照射和溴化乙锭的潜在致突变效应。
在这里，我们在Axygen凝胶成像系统-BL中使用蓝光与溴化乙锭替代染色剂SYBR®Safe和GelGreen®进行了一项限制检测研究，并使用UV 302与溴化乙锭进行了对比。对每个凝胶染色和光照组合的两个DNA片段(~6107 bp和~1746 bp)的连续稀释度进行评估，并使用凝胶分析软件从凝胶图像中测定最低浓度为1D。将SYBR®Safe和GelGreen®染色剂与蓝光结合使用，得到的DNA检测限度与使用溴化乙啶染色剂和紫外光302光照暴露的限度相当，证明了该仪器的多用途性。此外，还比较了蓝光和紫外光302照射下DNA的转化效率。
材料/方法
DNA 样品制备
质粒 DNA pCMV-SPORT-Bgal（Thermo Fisher Cat. No. 10586-014）在HindIII(693)和ScaI(6800) 位点使用限制性内切酶，双重消化进行切割以产生两个片段，长度约为 6107bp和1746bp。简而言之，将酶 HindIII-HF®（New England Biolabs (NEB) Cat. No. R3104）和 ScaI-HF®（NEB Cat. No. R3122）与质粒 DNA 以1.0µL酶/1.0µg DNA 的比例混合10X CutSmart® 缓冲液（NEB 目录号 B7204 S），用康宁分子生物学级水（康宁货号：46-000-CM）稀释十倍。双酶切在 37℃下孵育20分钟，然后通过在 80℃下加热灭活 20 分钟。消化后的DNA储存在-20℃。
凝胶电泳
通过将 2.25g琼脂糖 LE（康宁货号：AGR-LE-100）熔化在 225 mL 1X TBE 缓冲液中来制备琼脂糖凝胶（1%），该缓冲液是通过稀释 10X TBE 缓冲液（康宁货号：AGR-LE-100）制备的。46-011-CM) 十倍于康宁分子生物学级水中。就在将凝胶倒入带有两个 20 孔梳子的 15 x 15 cm 托盘之前，添加凝胶染料并使用 11.25 µL 溴化乙锭（Sigma-Aldrich 目录号 E1510-10ML）、22.5 µL SYBR Safe DNA 混合凝胶染色剂（Thermo Fisher Cat. No. S33102），或 22.5 µL GelGreen 核酸凝胶染料（Biotium 目录号 41005）。将固化的凝胶转移到 Axygen® 水平凝胶盒（康宁目录号 HGB-15）的主罐中，用 1X TBE 缓冲液填充至最大填充线。将 Axygen 1 Kb DNA 阶梯（康宁目录号 M-DNA-1kb）添加到两排泳道 1、20、21 和 40 的孔，6 µL/孔。对于 18 个样品，消化的 DNA 以 1:2 进行系列稀释，与 6X DNA 凝胶加载染料（Thermo Fisher Cat. No. R0611）混合，并加载到12 µL/孔进入泳道 2 至 19 和 22 至 39，加载的 DNA 总量从泳道 2 和 22 中的 200.00 ng 到泳道 19 和 39 中的 1.50 pg。凝胶在 110 伏恒定电压下运行 80 分钟.对于每个凝胶染色，DNA 样品独立运行两次，每个凝胶染色的每个 DNA 数量总共有四个泳道。
凝胶成像和分析
凝胶电泳后，立即使用 Axygen Gel Documentation System-BL 对每个凝胶进行成像。对于溴化乙锭染色的凝胶，使用 UV 302 光照射凝胶。对于用 SYBR Safe 和 GelGreen 染色的凝胶，使用蓝光照射凝胶。对于所有凝胶图像，使用泳道 1 和 21 中的梯子根据感兴趣区域 (ROI) 自动选择曝光时间。使用 TotalLab 1D 凝胶分析软件（14.0 版）分析凝胶图像，以及 DNA 片段大小和浓度是根据使用 1 Kb DNA 梯的校准确定的。可以检测到具有可量化 DNA 量 (> 0.00 ng) 的最低样品的 DNA 量被确定为每个凝胶染色的检测限。
转换效率
通过转化效率研究确定了 UV 302 和蓝光照射对 DNA 质量的影响。质粒 DNA pCMV-SPORT-Bgal 在分子生物学级水中稀释至 2.5 ng/µL，并在 1.7 mL 微量离心管（康宁目录号 3207）中分装到 10 µL 体积中。
对于每项研究，每个管都在 Axygen 凝胶成像系统-BL 中暴露于蓝光或 UV 302 光下 1、2、4、7 或 10 分钟。未暴露于蓝光或 UV 302 光的储备 DNA 用作阳性对照。 MAX Efficiency® DH5α™ 感受态细胞（Thermo Fisher Cat. No. 18258-012）用 DNA 样品转化。简而言之，将细胞在冰上解冻，并在每个冷却的 17 x 100 毫米聚丙烯管中用 1 微升 DNA 等分100 微升。细胞在冰上孵育30分钟，42°C热激45秒，放冰2分钟。细胞用 0.9 mL S.O.C.按 1:10 稀释。培养基（康宁目录号 46-003-CR）并在 37°C 下以 225 rpm 摇动孵育 1 小时。使用 1:100 稀释培养物S.O.C.培养基，将 100 µL 稀释液涂抹在含有 100 µg/mL 氨苄青霉素、60 µg/mL X-gal 和 0.1 mM IPTG（Teknova 目录号 L1902）的 LB 琼脂平板上，用于过夜培养。计算菌落形成单位 (CFU) 的数量以确定转化效率。
结果/讨论
凝胶电泳后，立即使用 Axygen® Gel Documentation System-BL 对每块凝胶进行成像。用溴化乙锭染色的凝胶用 UV 302 光照射，而用 SYBR® Safe 和 GelGreen 染色的凝胶用蓝光照射。从代表性 SYBR Safe 凝胶图像中可以看出，泳道 1、20、21 和 40 包含具有大小介于 300 至 10,000 bp 之间的 DNA 条带的 Kb DNA 阶梯（图 1）。在泳道 2 和 22 中可以观察到最粗和最亮的条带，代表大约 ~6107 bp 和 ~1746 bp DNA 片段，其中接收了 200.00 ng 的总 DNA。随着 DNA 量在凝胶上从左到右稀释，样品 DNA 条带的厚度和亮度也降低。
通过使用 TotalLab 1D 凝胶分析软件并将样品 DNA 条带校准到已知的 DNA 条带大小和加载到 1 Kb 阶梯中的数量，计算出每个泳道中检测到的 DNA 量。无论凝胶染色或光源如何，在每个泳道中检测到的 DNA 量在整个凝胶中都减少，与加载的 DNA 量直接相关（图 2）。根据对 1 Kb DNA 阶梯的校准，确定并计算出可检测和计算的最低 DNA 量，并使用核酸凝胶染色剂和光源类型的每种组合进行比较。检测限列于表 1 中，作为从 4 次独立实验中检测到的最低 DNA 量范围。使用带有 UV 302 光的溴化乙锭，较大的 DNA 片段 (~6107 bp) 的检测限低至 6.25 ng，而较小的 DNA 片段 (~1746) 的检测限低至 50.00 ng。使用蓝光 SYBR Safe DNA 凝胶染色剂产生的检测限与两种 DNA 片段的溴化乙锭/UV 302 检测限相当。然而，使用带有蓝光的 GelGreen 核酸凝胶染色剂导致检测限低至 3.13 ng~6107 bp 片段和 ~1746 bp 片段的 12.5 ng。对于 GelGreen 核酸凝胶染料，与溴化乙锭或 SYBR 安全检测限相比，4 项独立研究的检测限变化范围更大。当纳入检测限范围时，使用带有蓝光的 SYBR Safe 或 GelGreen 染料证明
检测限至少与使用溴化乙锭和 UV 302 光相当。UV 302 光和蓝光照射对 DNA 质量的影响是通过对 MAX Efficiency DH5α 感受态细胞进行转化效率研究来评估的，这些细胞的 DNA 已经暴露于 UV 302 或蓝光下 1 到 10 分钟。暴露于 UV 302 的 DNA 显示UV 302 暴露 2 分钟后转化效率为阳性对照（无光暴露）的一半，UV 302 暴露 10 分钟内转化效率为 0（即未形成菌落）（图 3）。然而，暴露于蓝光下的 DNA 并未表现出转化效率随时间的下降，在蓝光暴露 10 分钟的过程中保持与阳性对照相当的 CFU 水平。
结论
- Axygen® 凝胶文档系统-BL 与常用的核酸凝胶染料兼容，包括溴化乙锭、SYBR® Safe 和 GelGreen®。
- 使用 Axygen 凝胶文档系统-BL 的各种功能，每种凝胶染色的两种不同 DNA 条带大小都观察到了可比的低检测限。
- Axygen 凝胶文档系统-BL 具有蓝光功能，可与溴化乙锭替代染料一起使用，从而在检测限研究中具有相当的灵敏度。
- Axygen Gel Documentation System-BL 的蓝光特性不会对 DNA 的质量产生负面影响，这是通过将 DNA 直接暴露在光线下长达 10 分钟后的转化效率来衡量的。
表 1. 检测到的最低 DNA 量范围 (ng)
| 染色/光源 | 埃特布尔/紫外线 302 | SYBR 安全/BL | 凝胶绿/BL |
| ~6107 bp 波段 | 6.25-12.50 | 6.25-12.50 | 3.13-6.25 |
| ~1746 bp 波段 | 50.00-100.00 | 50.00 | 12.50-25.00 |
图1.代表性凝胶图像。使用 1X SYBR Safe 核酸染色剂浇铸 1% 琼脂糖凝胶。将被切割成两个片段（6107 bp 1746 bp）的质粒 DNA pCMVSPORT-Bgal 的 1:1 稀释系列添加到泳道2至19和 22 至 39 中，泳道中的量最高（200.00 ng）2 和 22 以及泳道 19 和 39 中的最低数量 (1.50 pg)。将 1 Kb 梯形 DNA 标记物 (6 µL) 添加到泳道 1、20、21 和 40。电泳后，使用 Axygen 凝胶文档系统-BL 用蓝光照射琼脂糖凝胶以进行图像捕获。
图 2. DNA 定量检测限。检测到的总 DNA 量（根据将样品校准到 Axygen 1 Kb DNA 分子量标准而确定）在整个凝胶中减少，与加载的 DNA 量减少直接相关。显示了来自用蓝光照射的 SYBR Safe 染色凝胶的代表性数据。条带 1 ~6107 bp，条带 2 ~1746 bp。
图 3. DNA 暴露在光下的转化效率。将 DNA 等分试样直接暴露于 UV 302 或蓝光下长达 10 分钟。暴露的 DNA 的转化效率是通过使用 MAX Efficiency DH5α 感受态细胞确定的，该细胞使用光照后的 DNA。暴露于 UV 302 的 DNA 的转化效率在暴露 10 分钟的过程中显着降低至 0，而与阳性对照（无光暴露）相比，暴露于蓝光的 DNA 的转化效率没有显着变化。 N = 3 项独立研究。黑线 = 无光阳性对照的平均值。